Co je základem hybridizace DNA? Ačkoli je sekvence dvouřetězcové DNA za fyziologických podmínek obecně stabilní, změna těchto podmínek v laboratoři (typicky zvýšením okolní teploty) způsobí, že se molekuly rozdělí na jednotlivá vlákna. Ty jsou vzájemně komplementární, ale mohou také doplňovat jiné sekvence přítomné v jejich prostředí. Snížení okolní teploty umožňuje jednořetězcovým molekulám žíhat nebo "hybridizovat" mezi sebou. Toto je metoda hybridizace DNA.
Koncept z pohledu molekulární biologie
Vědci, kteří se podílejí jak na replikaci DNA, tak na transkripci DNA do RNA, spoléhají na křížení nukleotidů a techniky molekulární biologie. To zahrnuje Southern a Northern bloty, polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a většinu přístupů k hybridizaci a sekvenování DNA-RNA.
Aplikace
Hybridizace je hlavní vlastností nukleotidusekvencí a používá se v řadě metod molekulární biologie. Celkovou genetickou příbuznost dvou druhů lze určit hybridizací segmentů jejich DNA (hybridizace DNA-DNA). Kvůli podobnosti sekvencí mezi blízce příbuznými organismy je k roztavení takových hybridů DNA vyžadována vyšší teplota ve srovnání se vzdálenějšími organismy. Různé metody využívají hybridizaci k určení původu vzorku DNA, včetně polymerázové řetězové reakce (PCR). V jiném způsobu se krátké sekvence DNA hybridizují s buněčnou mRNA, aby se identifikovaly exprimované geny. Farmaceutické společnosti zkoumají použití antisense RNA k navázání na nechtěnou mRNA, čímž zabrání ribozomu převést mRNA na protein.
DNA-DNA hybridizace obecně označuje techniku molekulární biologie, která měří stupeň genetické podobnosti mezi soubory sekvencí DNA. Běžně se používá k určení genetické vzdálenosti mezi dvěma organismy. Je široce používán ve fylogenezi a taxonomii.
Metodika
DNA z jednoho organismu byla označena a poté smíchána s neznačenou DNA, kterou bylo možné s ní porovnat. Směs se inkubuje, aby se řetězcům DNA umožnila disociovat, a poté se ochladí, aby se vytvořila regenerovaná hybridní dvouřetězcová DNA. Hybridizované sekvence s vysokým stupněm podobnosti se budou vázat těsněji a vyžadují více energie k jejich oddělení: tj. oddělují se při zahřátí na vyšší teplotu.teplotu než rozdílné sekvence, proces známý jako "tavení DNA".
Tání DNA
Při vyhodnocení profilu tání hybridizované DNA je dvouřetězcová DNA navázána na tzv. „sloupec“a výsledná směs se zahřívá. V každém kroku se kolona promyje a sekvence DNA, které tají, se stanou jednovláknovými a vymyjí se z kolony. Teploty, při kterých značená DNA opouští kolonu, odráží míru podobnosti mezi sekvencemi (a samoskládací vzor slouží jako kontrola). Tyto výsledky se spojí, aby se určil stupeň genetické podobnosti mezi organismy. Podle moderní mikrobiologie je hybridizace DNA nemožná bez pochopení těchto věcí.
Když je tímto způsobem porovnáno více druhů ribonukleové kyseliny (nebo deoxyribonukleové kyseliny), hodnoty podobnosti umožňují zařazení druhů do fylogenetického stromu. Proto je to jeden z možných přístupů k provádění molekulární systematiky. Charles Sibley a John Ahlquist, průkopníci této techniky, použili hybridizaci DNA-DNA ke studiu fylogenetických vztahů ptáků (taxonomie Sibley-Ahlquist) a primátů.
Význam pro biologii
Hybridizace DNA-DNA je zlatým standardem pro rozlišení bakteriálních druhů s hodnotou podobnosti více než 70 %, což naznačuje, že porovnávané kmeny patří k různým druhům. V roce 2014 byl pro oddělení bakteriálního poddruhu navržen práh 79% podobnosti.
Kritici tvrdí, že tato technika je nepřesná pro srovnávání blízce příbuzných druhů, protože jakýkoli pokus o měření rozdílů mezi ortologickými sekvencemi mezi organismy je přemožen hybridizací paralogních protějšků v genomu organismu. Sekvenování DNA a výpočetní porovnávání sekvencí jsou v současné době běžně používanou metodou pro určování genetické vzdálenosti, ačkoli tento přístup se stále používá v mikrobiologii k identifikaci bakterií.
Současným způsobem je provedení hybridizace DNA-DNA v silikonu pomocí plně nebo částečně sekvenovaných genomů. GGDC vyvinutý DSMZ je nejpřesnějším známým nástrojem pro výpočet hodnot podobných DDH. Kromě dalších algoritmických vylepšení řeší problém s paralogními sekvencemi jejich pečlivým odfiltrováním ze shod mezi dvěma sekvencemi genomu.
Metoda RYBY
Fluorescence In situ Hybridization (FISH) je laboratorní technika používaná k detekci a sekvenování DNA, často na specifickém chromozomu.
V roce 1969 publikovali Joseph Gall a Mary Lou Pardu dokument, který demonstroval, že radioaktivní kopie sekvence ribozomální DNA lze použít k detekci komplementárních sekvencí DNA v jádře žabího vejce. Od těchto původních pozorování mnoho vylepšení zvýšila všestrannost acitlivost postupu do takové míry, že hybridizace in situ („na místě“, latinsky) je dnes považována za důležitý nástroj cytogenetiky. (Termín in situ se nyní také používá k označení počátečního stadia růstu karcinomu, kdy se patologického procesu účastní pouze epiteliální tkáň.)
Fluorescenční hybridizační sekvence
Sondy RNA mohou být navrženy pro jakýkoli gen nebo jakoukoli sekvenci v genu pro vizualizaci lncRNA a miRNA mRNA v tkáních a buňkách. FISH se používá při studiu cyklu reprodukce buněk, zejména jaderné interfáze pro jakékoli chromozomální abnormality. FISH umožňuje analyzovat velkou sérii archivních případů, je mnohem snazší identifikovat identifikovaný chromozom vytvořením sondy s umělou chromozomovou bází, která bude přitahovat podobné chromozomy.
Hybridizační signály pro každou sondu, když je detekována jaderná abnormalita: každá detekční sonda mRNA a lncRNA se skládá z 20 párů oligonukleotidů, každý pár pokrývá prostor 40-50 bp. p. Sondy používají proprietární chemii k detekci mRNA.
Hybridizace s DNA sondami
Sondy se často vyrábějí z fragmentů DNA, které byly izolovány, purifikovány a amplifikovány pro použití při návrhu lidského genomu. Velikost lidského genomu je tak velká ve srovnání s délkou, kterou lze přímo sekvenovat, že je nutné jej rozdělit nafragmenty. Nakonec byly tyto fragmenty uspořádány štěpením kopie každého fragmentu na ještě menší jednotky pomocí sekvenčně specifických endonukleáz k měření velikosti každého malého fragmentu pomocí vylučovací chromatografie s použitím této informace k určení, kde se velké fragmenty navzájem překrývají..
Pro zachování prvků s jejich individuálními sekvencemi DNA byly fragmenty přidány do systému stále se opakujících bakteriálních populací. Klonální populace bakterií, z nichž každá si udržuje jeden umělý chromozom, jsou uloženy v různých laboratořích po celém světě. Umělé chromozomy (BAC) lze pěstovat, extrahovat a značit v jakékoli laboratoři obsahující knihovnu. Genomické knihovny jsou často pojmenovány podle institucí, kde byly vyvinuty. Příkladem je knihovna RPCI-11, pojmenovaná po Roswell Cancer Institute v Buffalu (New York, USA). Tyto fragmenty tvoří asi 100 tisíc párů bází a jsou základem většiny sond FISH.
