Molekulárně biologické metody výzkumu hrají velkou roli v moderní medicíně, forenzní a biologii. Díky pokroku ve studiu DNA a RNA je člověk schopen studovat genom organismu, určit původce nemoci, rozpoznat požadovanou nukleovou kyselinu ve směsi kyselin atd.
Metody molekulárně biologického výzkumu. Co to je?
V 70. a 80. letech se vědcům poprvé podařilo rozluštit lidský genom. Tato událost dala impuls rozvoji genetického inženýrství a molekulární biologie. Studium vlastností DNA a RNA vedlo k tomu, že je nyní možné použít tyto nukleové kyseliny k diagnostice onemocnění, ke studiu genů.
Získání DNA a RNA
Molekulárně biologické diagnostické metody vyžadují přítomnost výchozího materiálu: častěji jsou to nukleové kyseliny. Existuje několik způsobů, jak tyto látky izolovat z buněk živých organismů. Každý z nich má své výhody a nevýhody a je nezbytnývzít v úvahu při výběru metody pro izolaci čistých nukleových kyselin.
1. Získání DNA podle Marmura. Metoda spočívá v ošetření směsi látek alkoholem, v důsledku čehož se vysráží čistá DNA. Nevýhodou této metody je použití agresivních látek: fenol a chloroform.
2. Izolace DNA podle Booma. Hlavní látkou zde používanou je guanidinthiokyanát (GuSCN). Přispívá k vysrážení deoxyribonukleové kyseliny na specializovaných substrátech, ze kterých ji lze následně sbírat pomocí speciálního pufru. GuSCN je však inhibitorem PTC a i jeho malá část, která se dostane do vysrážené DNA, může ovlivnit průběh polymerázové řetězové reakce, která hraje důležitou roli při práci s nukleovými kyselinami.
3. Sedimentace nečistot. Metoda se od předchozích liší tím, že se nesrážejí molekuly deoxyribonukleové kyseliny, ale nečistoty. K tomu se používají iontoměniče. Nevýhodou je, že ne všechny látky se mohou vysrážet.
4. Hromadné promítání. Tato metoda se používá v případech, kdy nejsou potřeba přesné informace o složení molekuly DNA, ale je nutné získat nějaké statistické údaje. To je vysvětleno skutečností, že struktura nukleové kyseliny může být poškozena při ošetření detergenty, zejména alkáliemi.
Klasifikace výzkumných metod
Všechny molekulárně biologické výzkumné metody jsou rozděleny do tří velkých skupin:
1. Amplifikace (pomocí mnoha enzymů). Tadyoznačuje PCR - polymerázovou řetězovou reakci, která hraje velkou roli v mnoha diagnostických metodách.
2. Nezesilující. Tato skupina metod přímo souvisí s provozem směsí nukleových kyselin. Příklady jsou 3 bloty, hybridizace in situ atd.
3. Metody založené na rozpoznání signálu z molekuly sondy, která se váže na specifickou sondu DNA nebo RNA. Příkladem je Hybride Capture System (hc2).
Enzymy, které lze použít v metodách výzkumu molekulární biologie
Mnoho molekulárních diagnostických metod zahrnuje použití široké škály enzymů. Níže jsou nejčastěji používané:
1. Restrikční enzym - "nařeže" molekulu DNA na potřebné části.
2. DNA polymeráza – syntetizuje dvouvláknovou molekulu deoxyribonukleové kyseliny.
3. Reverzní transkriptáza (revertáza) – používá se k syntéze DNA na šabloně RNA.
4. DNA ligáza - zodpovědná za tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy.
5. Exonukleáza – odstraňuje nukleotidy z koncových úseků molekuly deoxyribonukleové kyseliny.
PCR je hlavní metoda amplifikace DNA
Polymerázová řetězová reakce (PCR) se aktivně používá v moderní molekulární biologii. Jedná se o metodu, při které lze z jedné molekuly DNA získat obrovské množství kopií (molekuly jsou amplifikovány).
Hlavní funkce PCR:
– diagnostikanemoci;
- klonování segmentů DNA, genů.
K provedení polymerázové řetězové reakce jsou nutné následující prvky: počáteční molekula DNA, termostabilní DNA polymeráza (Taq nebo Pfu), deoxyribonukleotidové fosfáty (zdroje dusíkatých bází), primery (2 primery na 1 molekulu DNA) a samotný nárazníkový systém, ve kterém jsou možné všechny reakce.
PCR se skládá ze tří kroků: denaturace, žíhání primeru a elongace.
1. Denaturace. Při teplotě 94-95 stupňů Celsia se vodíkové vazby mezi dvěma řetězci DNA přeruší a výsledkem jsou dvě jednořetězcové molekuly.
2. Žíhání základního nátěru. Při teplotě 50-60 stupňů Celsia jsou primery připojeny ke koncům molekul jednořetězcové nukleové kyseliny podle typu komplementarity.
3. Prodloužení. Při teplotě 72 stupňů dochází k syntéze dceřiných dvouvláknových molekul deoxyribonukleové kyseliny.
Sekvenování DNA
Metody molekulárně biologického výzkumu často vyžadují znalost nukleotidové sekvence v molekule deoxyribonukleové kyseliny. K určení genetického kódu se provádí sekvenování. Molekulární diagnostika budoucnosti bude založena na znalostech získaných lidským sekvenováním.
Rozlišují se následující typy sekvenování:
- Maxam-Gilbertovo sekvenování;
- Sangerovo sekvenování;
- pyrosequencing;
- nanoporesekvenování.
