Při studiu látek v organické chemii se ke stanovení obsahu určitých sloučenin používá více než tucet různých kvalitativních reakcí. Taková vizuální analýza vám umožní okamžitě pochopit, zda jsou přítomny potřebné látky, a pokud nejsou přítomny, můžete výrazně omezit další experimenty na jejich identifikaci. Tyto reakce zahrnují ninhydrin, který je hlavní reakcí při vizuálním stanovení aminosloučenin.
Co je to?
Ninhydrin je dikarbonylová sloučenina obsahující jeden aromatický kruh s připojeným heterocyklem, jehož druhý atom má 2 hydroxylové skupiny (OH-). Tato látka se získává přímou oxidací inandionu - 1, 3, a proto má podle mezinárodní nomenklatury tento název: 2, 2 - dihydroxyinandion -1, 3 (obr. 1).
Čistý ninhydrin je žlutý nebo bílý krystalbarvy, které se po zahřátí dobře rozpouštějí ve vodě a dalších polárních organických rozpouštědlech, jako je aceton. Jedná se o poměrně škodlivou látku, pokud se dostane do kontaktu s kůží ve větším množství nebo se sliznicemi, způsobuje podráždění, a to i při vdechování. Práce s touto sloučeninou by měla být opatrná a pouze v rukavicích, protože při kontaktu s pokožkou reaguje s proteiny kožních buněk a barví ji do fialova.
Reaktivní látky
Jak bylo uvedeno výše, ninhydrinová reakce se používá především pro vizuální stanovení obsahu aminosloučenin:
- α-aminokyseliny (včetně bílkovin);
- amino cukry;
- alkaloidy obsahující –NH2 a -NH skupiny;
- různé aminy.
Je třeba poznamenat, že sekundární a terciární aminy někdy reagují velmi slabě, takže k potvrzení jejich přítomnosti je zapotřebí další výzkum.
Pro kvantitativní stanovení se používají různé metody chromatografie, např. papírová chromatografie (BC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC) nebo s promýváním pevných nosičů roztokem ninhydrinu v různých médiích.
Tato reakce není specifická pro aminosloučeniny, protože činidlo do ní může vstoupit se všemi najednou. Na straně reakčních produktů má však zvláštnost v podobě uvolňování bublin oxidu uhličitého (CO2), což je typické pouze při interakci s α-amino kyseliny.
Funkce mechanismu
BV literatuře existují různé interpretace rovnice ninhydrinové reakce. Někteří badatelé opomíjejí vznik hydrindanthinu z 2-aminoinandionu, který za účasti amoniaku a ninhydrinu tvoří také barvicí látku zvanou „Ruemanův purpur“(nebo „Ruemanova modř“), jiní naopak předpokládají pouze jeho účast bez přítomnosti meziproduktů amino. V záznamu samotné reakce je také několik zajímavých bodů, konkrétně se to týká způsobů připojení aminoderivátu ninhydrinu k jeho hlavní molekule za vzniku barviva. Označení místa „chodícího vodíku“získaného meziproduktovým aminem z vodného prostředí také zůstává sporné: může být buď v ketonové skupině, nebo vedle –NH2.
Ve skutečnosti je nuance s atomem H bezvýznamná, protože jeho poloha ve sloučenině nehraje v průběhu reakce zvláštní roli, takže by se jí nemělo věnovat pozornost. Pokud jde o vynechání jedné z možných etap, důvod zde spočívá v teoretickém aspektu: dosud nebyl přesně stanoven přesný mechanismus vzniku Ruemanova purpuru, lze tedy nalézt zcela odlišná schémata ninhydrinové reakce.
Nejúplnější možný průběh interakce činidla s aminosloučeninami bude navržen níže.
Reakční mechanismus
Ninhydrin nejprve interaguje s α-aminokyselinou, připojí ji v místě štěpení hydroxyskupin a vytvoří kondenzační produkt (obr. 2a). Potom je posledně jmenovaný zničen, přičemž se uvolňuje meziprodukt amin, aldehyd a oxid uhličitý (obr. 2b). Z finálního produktu při spojováníninhydrinem, je syntetizována Ruemanova purpurová struktura (diketonhydrindenketohydrinamin, obr. 2c). Naznačena je také možná tvorba hydrindanthinu (redukovaného ninhydrinu) z meziproduktu aminu, který se také v přítomnosti amoniaku (přesněji hydroxidu amonného) s přebytkem samotného činidla (obr. 2d) mění na barvicí sloučeninu (obr. 2d).
Tvorbu hydrindantinu dokázal sám Rueman, když sirovodík působí na molekulu ninhydrinu. Tato sloučenina je schopna se rozpustit v uhličitanu sodném Na2CO3, čímž se roztok zbarví tmavě červeně. A když se přidá zředěná kyselina chlorovodíková, vysráží se hydrindanthin.
S největší pravděpodobností jsou meziprodukt amin, hydridanthin, ninhydrin a struktura barviva v důsledku jejich nestability při zahřívání v určité rovnováze, což umožňuje přítomnost několika dalších stupňů.
Tento mechanismus je vhodný pro vysvětlení reakce ninhydrinu s jinými aminosloučeninami, s výjimkou vedlejších produktů vzniklých eliminací zbytku struktury z –NH2, -NH nebo -N.
Biuretový test a další reakce na proteiny
Kvalitativní analýza peptidových vazeb i neproteinových struktur může probíhat nejen za účasti výše uvedeného činidla. V případě ninhydrinové reakce na proteiny však interakce neprobíhá podél –CO-NH‒ skupin, ale podél aminových skupin. Dochází k tzv. „biuretové reakci“, která je charakteristická přidáním iontů do roztoku s aminosloučeninamibivalentní měď z CuSO4 nebo Cu(OH)2 v alkalickém prostředí (obr. 3).
Během analýzy, v přítomnosti nezbytných struktur, se roztok zbarví tmavě modře v důsledku vazby peptidových vazeb na barevný komplex, který odlišuje jedno činidlo od druhého. Proto jsou biuretové a ninhydrinové reakce univerzální ve vztahu k proteinovým i neproteinovým strukturám se skupinou –CO-NH‒.
Při stanovení cyklických aminokyselin se používá xantoproteinová reakce s koncentrovaným roztokem kyseliny dusičné HNO3 , která při nitraci dává žluté zbarvení. Kapka činidla na kůži také vykazuje žlutou barvu reakcí s aminokyselinami v kožních buňkách. Kyselina dusičná může způsobit popáleniny a mělo by se s ní také zacházet v rukavicích.
Příklady interakce s aminosloučeninami
Ninhydrinová reakce pro α-aminokyseliny poskytuje dobrý vizuální výsledek, kromě barevných prolinových a hydroxyprolinových struktur, které reagují za vzniku žluté barvy. Možné vysvětlení tohoto efektu bylo nalezeno v jiných podmínkách prostředí interakce ninhydrinu s těmito strukturami.
Reakce s aminoskupinou
Vzhledem k tomu, že test není specifický, vizuální detekce alaninu pomocí ninhydrinové reakce ve směsi není možná. Papírovou chromatografií při aplikaci vzorků různých α-aminokyselin, jejich postřikem vodným roztokem ninhydrinu a vyvoláním ve speciálním médiu však lzevypočítat kvantitativní složení nejen nárokované sloučeniny, ale také mnoha dalších.
Schematicky se interakce alaninu s ninhydrinem řídí stejným principem. Naváže se na činidlo na aminoskupině a působením aktivních hydroniových iontů (H3O+) se odštěpuje na uhlíku -dusíková vazba, rozkládající se na acetaldehyd (CH3COH) a oxid uhličitý (CO2). Další molekula ninhydrinu se naváže na dusík, vytlačí molekuly vody a vytvoří se barevná struktura (obr. 4).
Reakce s heterocyklickou aminosloučeninou
Reakce ninhydrinu s prolinem je specifická zejména při chromatografických analýzách, protože takové struktury v kyselém prostředí nejprve žloutnou a v neutrálním prostředí se zbarvují do fialova. Vědci to vysvětlují rysem přeskupení cyklu v meziproduktu, který je ovlivněn právě přítomností velkého počtu vodíkových protonů, které doplňují vnější energetickou hladinu dusíku.
Destrukce heterocyklu nenastane a na 4. atomu uhlíku je k němu připojena další molekula ninhydrinu. Při dalším zahřívání se výsledná struktura v neutrálním médiu změní na Ruemanovu fialovou (obr. 5).
Příprava hlavního činidla
Ninhydrinový test se provádí s různými roztoky v závislosti na rozpuštění aminostruktur v určitých organických aanorganické sloučeniny.
Hlavním činidlem je příprava 0,2% roztoku ve vodě. Jedná se o všestrannou směs, protože většina sloučenin se dobře rozpouští v H2O. K získání čerstvě připraveného činidla se vzorek 0,2 g chemicky čistého ninhydrinu zředí ve 100 ml vody.
Za zmínku stojí, že pro některé analyzované roztoky je tato koncentrace nedostatečná, takže lze připravit 1% nebo 2% roztoky. To je typické pro extrakty z léčivých surovin, protože obsahují různé třídy aminosloučenin.
Při provádění chromatografických studií lze roztoky, například při promývání směsi na pevném nosiči přes kolonu, připravit v alkoholu, dimethylsulfoxidu, acetonu a dalších polárních rozpouštědlech - vše bude záviset na rozpouštědle určitých amino struktury.
Aplikace
Ninhydrinová reakce umožňuje detekovat mnoho aminosloučenin v roztoku, díky čemuž je jednou z prvních, které byly použity v kvalitativní analýze organických látek. Vizuální určování výrazně snižuje počet experimentů, zejména při analýze špatně prozkoumaných rostlin, léčiv a lékových forem, stejně jako neznámých roztoků a směsí.
Ve forenzní vědě se tato metoda široce používá k určení přítomnosti potních stop na jakémkoli povrchu.
I přes nespecifičnost reakce je stažení ninhydrinové reakce z chemické praxe nemožné, protoženahrazení této látky méně toxickými analogy (např. oxolin) prokázalo, že mají horší citlivost na aminoskupiny a nedávají dobré výsledky ve fotometrických analýzách.
