Metoda tkáňových kultur je jedním z hlavních nástrojů moderní biotechnologie, který umožňuje řešit praktické problémy rostlinné fyziologie, biochemie a genetiky. Umělá kultivace materiálu se provádí za určitých podmínek: sterilizace, kontrola teploty a vystavení speciálnímu živnému médiu.
Essence
Metodou tkáňových kultur je jejich dlouhodobá konzervace a/nebo umělá kultivace v laboratorních podmínkách na živném médiu. Tato technologie vám umožňuje vytvořit biologický model pro studium různých procesů v buňkách, které existují mimo tělo rostlin, lidí a zvířat.
Reprodukce rostlinné tkáňové kultury je založena na vlastnosti totipotence - schopnosti buněk vyvinout se v celý organismus. U zvířat k tomu dochází pouze u oplozených vajíček (s výjimkou některých typů koelenterátů).
Historie vývoje
První pokusy o kultivaci rostlinných tkání provedli němečtí vědci na přelomu 19. a 20. století. Navzdory tomu, že byly neúspěšné, byla formulována řada nápadů, které byly později potvrzeny.
V roce 1922 dokázali W. Robbins a W. Kotte nezávisle na sobě vypěstovat špičky kořenů kukuřice a rajčat na umělé živné půdě. Podrobné studium technik buněčných a tkáňových kultur začalo ve 30. letech 20. století. 20. století R. Gautre a F. White dokázali, že s periodickou transplantací tkáňových kultur do čerstvého živného média mohou růst donekonečna.
Do roku 1959 se v laboratorních podmínkách pěstovalo 142 druhů rostlin. Ve druhé polovině XX století. také se začalo používat rozptýlené (oddělené) buňky.
Typy zkušebního materiálu
Existují 2 hlavní typy rostlinných tkáňových kultur:
- Vyrábí se bez ničení a se zachováním charakteristických rysů, které jsou vlastní živému organismu.
- Extrahuje se degradací (chemickou, enzymatickou nebo mechanickou) z primární tkáně. Může být vytvořen z jedné nebo více buněčných kultur.
Způsobem pěstování se rozlišují následující metody:
- na "výživné vrstvě", ve které je látka, která stimuluje růst tkání, vylučována dělením buněk stejného rostlinného druhu;
- použití tkáně sestry vedle kultivovaných buněk;
- použití živného média z izolované skupiny buněk, která se dělí;
- pěstování jednotlivých jednotlivých buněk v mikrokapce nasycené složením.
Kultivace z jednotlivých buněk je zatížena určitými obtížemi. Aby je uměle „donutili“se dělit, musí přijmout signál ze sousedních, aktivně fungujících buněk.
Jedním z hlavních typů tkání pro fyziologický výzkum je kalus, který vzniká pod nepříznivými vnějšími faktory (obvykle mechanické poranění). Mají schopnost ztratit specifické vlastnosti vlastní původní tkáni. V důsledku toho se buňky kalusu začnou aktivně dělit a tvoří se části rostliny.
Nezbytné podmínky
Úspěch metody tkáňové a buněčné kultury závisí na následujících faktorech:
- Dodržování sterility. Pro transplantaci se používají speciální boxy s přiváděným čištěným vzduchem, vybavené ultrafialovými lampami. Nástroje a materiály, oděvy a ruce personálu by měly být podrobeny aseptickému zpracování.
- Použití speciálně vybraných živných médií obsahujících zdroje uhlíku a energie (obvykle sacharóza a glukóza), mikro- a makroživiny, regulátory růstu (auxiny, cytokininy), vitamíny (thiamin, riboflavin, kyselina askorbová a pantotenová a další).
- Shoda s teplotou (18-30 °C), světelnými podmínkami a vlhkostí (60-70%). Většina kalusových tkáňových kultur se pěstuje při okolním světle, protože neobsahují chloroplasty, ale některé rostliny vyžadují podsvícení.
Momentálně připravenokomerční sestavy (Murasige a Skoog, Gamborg a Eveleg, White, Kao a Mikhailyuk a další).
Pro a proti
Výhody metody kultivace buněk a tkání jsou:
- dobrá reprodukovatelnost získaných výsledků;
- regulace mezibuněčných interakcí;
- nízká spotřeba činidel;
- genetická homogenita buněčných linií;
- možnost mechanizace procesu pěstování;
- kontrola nad podmínkami klece;
- skladování živých kultur při nízké teplotě.
Nevýhoda této biotechnologie je:
- musíte dodržovat přísné podmínky asepse;
- nestabilita vlastností buněk a možnost jejich nežádoucího smíchání;
- vysoké náklady na chemikálie;
- neúplná ekvivalence kultivovaných tkání a buněk v živém organismu.
Aplikace
Metoda tkáňové kultury použitá pro výzkum:
- procesy uvnitř buněk (syntéza DNA, RNA a proteinů, metabolismus a jeho ovlivnění pomocí léků);
- mezibuněčné reakce (průchod látek buněčnými membránami, práce komplexu hormon-receptor, schopnost buněk k sobě přilnout, tvorba histologických struktur);
- interakce s prostředím (vstřebávání živin, přenos infekcí, procesy vzniku a vývojenádory a další);
- výsledky genetických manipulací s buňkami.
Slibné oblasti biologie a farmakologie, při jejichž vývoji se tato technologie využívá, jsou:
- získávání účinných herbicidů, regulátorů růstu pro agronomické plodiny, biologicky aktivních sloučenin pro použití při výrobě léčiv (alkaloidy, steroidy a další);
- řízená mutageneze, šlechtění nových hybridů, překonání postgamické nekompatibility;
- klonální množení, které vám umožní získat velké množství geneticky identických rostlin;
- šlechtění rostlin odolných vůči virům a bez virů;
- kryoprezervace genofondu;
- rekonstrukce tkání, vytváření zdrojů kmenových buněk (tkáňové inženýrství).
