Protein je nezbytnou součástí všech organismů. Každá z jeho molekul se skládá z jednoho nebo více polypeptidových řetězců sestávajících z aminokyselin. Přestože jsou informace nezbytné pro život zakódovány v DNA nebo RNA, rekombinantní proteiny plní v organismech širokou škálu biologických funkcí, včetně enzymatické katalýzy, ochrany, podpory, pohybu a regulace. Podle jejich funkcí v těle lze tyto látky rozdělit do různých kategorií, jako jsou protilátky, enzymy, strukturální složka. Vzhledem k jejich důležitým funkcím byly tyto sloučeniny intenzivně studovány a široce používány.
V minulosti bylo hlavním způsobem, jak získat rekombinantní protein, jeho izolace z přírodního zdroje, což je obvykle neefektivní a časově náročné. Nedávné pokroky v biologické molekulární technologii umožnily klonovat DNA kódující specifickou sadu látek do expresního vektoru pro látky, jako jsou bakterie, kvasinky, hmyzí buňky a savčí buňky.
Jednoduše řečeno, rekombinantní proteiny jsou překládány exogenními produkty DNA doživé buňky. Jejich získání obvykle zahrnuje dva hlavní kroky:
- Klonování molekuly.
- Výraz bílkovin.
V současné době je výroba takové struktury jednou z nejvýkonnějších metod používaných v medicíně a biologii. Složení má široké uplatnění ve výzkumu a biotechnologii.
Lékařský směr
Rekombinantní proteiny poskytují důležitou léčbu různých onemocnění, jako je cukrovka, rakovina, infekční onemocnění, hemofilie a anémie. Typické formulace takových látek zahrnují protilátky, hormony, interleukiny, enzymy a antikoagulanty. Existuje rostoucí potřeba rekombinantních formulací pro terapeutické použití. Umožňují vám rozšířit léčebné metody.
geneticky upravené rekombinantní proteiny hrají klíčovou roli na trhu terapeutických léků. Savčí buňky v současnosti produkují nejvíce terapeutických činidel, protože jejich formulace jsou schopné produkovat vysoce kvalitní látky podobné přírodním. Kromě toho je v E. coli produkováno mnoho schválených rekombinantních terapeutických proteinů díky dobré genetice, rychlému růstu a vysoké produktivitě. Má také pozitivní vliv na vývoj léků na bázi této látky.
Výzkum
Získání rekombinantních proteinů je založeno na různých metodách. Látky pomáhají zjistit základní a základní principy těla. Tyto molekuly lze použít k identifikaci a určeníumístění látky kódované konkrétním genem a odhalit funkci jiných genů v různých buněčných aktivitách, jako je buněčná signalizace, metabolismus, růst, replikace a smrt, transkripce, translace a modifikace sloučenin diskutovaných v článku.
Pozorované složení se tedy často používá v molekulární biologii, buněčné biologii, biochemii, strukturálních a biofyzikálních studiích a mnoha dalších vědních oborech. Zároveň je získávání rekombinantních proteinů mezinárodní praxí.
Takové sloučeniny jsou užitečnými nástroji pro pochopení mezibuněčných interakcí. Osvědčily se v několika laboratorních metodách, jako je ELISA a imunohistochemie (IHC). Rekombinantní proteiny mohou být použity k vývoji enzymových testů. Při použití v kombinaci s párem vhodných protilátek lze buňky použít jako standardy pro nové technologie.
Biotechnologie
Rekombinantní proteiny obsahující aminokyselinovou sekvenci se také používají v průmyslu, výrobě potravin, zemědělství a bioinženýrství. Například při chovu zvířat lze do potravin přidávat enzymy, aby se zvýšila nutriční hodnota složek krmiva, snížily se náklady a plýtvání, podpořilo se zdraví střev zvířat, zlepšila se produktivita a zlepšilo životní prostředí.
Kromě toho, bakterie mléčného kvašení (LAB) po dlouhou dobuse používají k výrobě fermentovaných potravin a nedávno byla vyvinuta LAB pro expresi rekombinantních proteinů obsahujících aminokyselinovou sekvenci, které lze široce použít například pro zlepšení trávení lidí, zvířat a výživy.
Tyto látky však mají také omezení:
- V některých případech je produkce rekombinantních proteinů složitá, nákladná a časově náročná.
- Látky produkované v buňkách nemusí odpovídat přirozeným formám. Tento rozdíl může snížit účinnost terapeutických rekombinantních proteinů a dokonce způsobit vedlejší účinky. Kromě toho může tento rozdíl ovlivnit výsledky experimentů.
- Hlavním problémem všech rekombinantních léků je imunogenicita. Všechny biotechnologické produkty mohou vykazovat určitou formu imunogenicity. Je obtížné předpovědět bezpečnost nových terapeutických proteinů.
Pokrok v biotechnologii obecně zvýšil a usnadnil produkci rekombinantních proteinů pro různé aplikace. I když stále mají určité nevýhody, tyto látky jsou důležité v medicíně, výzkumu a biotechnologii.
Odkaz na onemocnění
rekombinantní protein není pro člověka škodlivý. Je pouze nedílnou součástí celkové molekuly při vývoji konkrétního léčiva nebo nutričního prvku. Mnoho lékařských studií ukázalo, že nucená exprese proteinu FGFBP3 (zkráceně BP3) v laboratorním kmeni obézních myší prokázala významné snížení jejich tělesného tuku.hmotnost, navzdory genetické predispozici k užívání.
Výsledky těchto studií ukazují, že protein FGFBP3 může nabídnout novou terapii poruch spojených s metabolickým syndromem, jako je diabetes 2. typu a ztučnění jater. Ale protože BP3 je přírodní protein a ne umělý lék, klinické zkoušky rekombinantního lidského BP3 by mohly začít po posledním kole preklinických studií. To znamená, že existují důvody související s bezpečností provádění takových studií. Rekombinantní protein není pro člověka škodlivý díky jeho postupnému zpracování a čištění. Změny probíhají také na molekulární úrovni.
PD-L2, jeden z klíčových hráčů v imunoterapii, byl nominován na Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu za rok 2018. Tato práce, kterou zahájili Prof. James P. Allison z USA a Prof. Tasuku Honjo z Japonska, vedla k léčbě rakoviny, jako je melanom, rakovina plic a další, na základě kontrolní imunoterapie. Nedávno AMSBIO přidalo do své imunoterapeutické řady významný nový produkt, aktivátor PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
V experimentech prokazujících koncept vědci z University of Alabama v Birminghamu pod vedením H. Long Zheng, MD, profesora Roberta B. Adamse a ředitele laboratorního lékařství, Ústavu patologie, UAB School of Medicína upozornila na potenciální terapii vzácné, ale smrtelné krvácivé poruchy, TTP.
Výsledky tohostudie poprvé prokázaly, že transfuze krevních destiček naplněných rADAMTS13 může být novým a potenciálně účinným terapeutickým přístupem pro arteriální trombózu spojenou s vrozenou a imunitou zprostředkovanou TTP.
Rekombinantní protein není jen živina, ale také léčivo ve složení vyvíjeného léčiva. To je jen několik oblastí, které se nyní zabývají medicínou a souvisí se studiem všech jejích strukturálních prvků. Jak ukazuje mezinárodní praxe, struktura látky umožňuje na molekulární úrovni vypořádat se s mnoha vážnými problémy v lidském těle.
Vývoj vakcín
Rekombinantní protein je specifická sada molekul, kterou lze modelovat. Podobná vlastnost se využívá při vývoji vakcín. Nová vakcinační strategie, známá také jako použití speciální injekce rekombinantního viru, by mohla chránit miliony kuřat ohrožených vážným respiračním onemocněním, uvedli vědci z University of Edinburgh a Pirbright Institute. Tyto vakcíny používají neškodné nebo slabé verze viru nebo bakterie k zavedení choroboplodných zárodků do buněk těla. V tomto případě odborníci použili rekombinantní viry s různými spike proteiny jako vakcíny k vytvoření dvou verzí neškodného viru. Kolem tohoto spojení je postaveno mnoho různých léků.
Obchodní názvy a analogy rekombinantních proteinů jsou následující:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Jedná se především o léky proti rakovině, ale s touto účinnou látkou jsou spojeny i další oblasti léčby.
Nová vakcína, nazývaná také LASSARAB, určená k ochraně lidí proti horečce Lassa i vzteklině, vykázala slibné výsledky v preklinických studiích, uvádí nová studie zveřejněná ve vědeckém časopise Nature Communications. Kandidát na inaktivovanou rekombinantní vakcínu používá oslabený virus vztekliny.
Výzkumný tým vložil genetický materiál viru Lassa do vektoru viru vztekliny, aby vakcína exprimovala povrchové proteiny v buňkách Lassa i vzteklině. Tyto povrchové sloučeniny vyvolávají imunitní odpověď proti infekčním agens. Tato vakcína byla poté inaktivována, aby „zničila“živý virus vztekliny použitý k výrobě nosiče.
Jak získat metody
Existuje několik systémů pro výrobu látky. Obecný způsob získání rekombinantního proteinu je založen na získání biologického materiálu ze syntézy. Ale jsou i jiné způsoby.
V současné době existuje pět hlavních výrazových systémů:
- Expresní systém E. coli.
- Kvasinkový expresní systém.
- Systém exprese hmyzích buněk.
- Systém exprese savčích buněk.
- Bezbuněčný proteinový expresní systém.
Poslední možnost je zvláště vhodná pro expresi transmembránových proteinůa toxické sloučeniny. V posledních letech byly do buněk in vitro úspěšně integrovány látky, které jsou obtížně exprimovatelné běžnými intracelulárními metodami. V Bělorusku se široce využívá produkce rekombinantních proteinů. Existuje řada státních podniků, které se touto problematikou zabývají.
Cell Free Protein Synthesis System je rychlá a účinná metoda pro syntézu cílových látek přidáním různých substrátů a energetických sloučenin nezbytných pro transkripci a translaci v enzymatickém systému buněčných extraktů. V posledních letech se postupně objevily výhody bezbuněčných metod pro typy látek, jako jsou složité toxické membrány, což dokazuje jejich potenciální použití v biofarmaceutické oblasti.
Bezbuněčná technologie může snadno a kontrolovaným způsobem přidat různé přirozeně se nevyskytující aminokyseliny, aby se dosáhlo komplexních modifikačních procesů, které je obtížné vyřešit po konvenční rekombinantní expresi. Takové způsoby mají vysokou aplikační hodnotu a potenciál pro dodávání léčiv a vývoj vakcín s použitím částic podobných viru. Velké množství membránových proteinů bylo úspěšně exprimováno ve volných buňkách.
Vyjádření skladeb
Rekombinantní protein CFP10-ESAT 6 se vyrábí a používá k výrobě vakcín. Takový alergen tuberkulózy vám umožňuje posílit imunitní systém a vyvinout protilátky. Obecně molekulární studie zahrnují studium jakéhokoli aspektu proteinu, jako je struktura, funkce, modifikace, lokalizace nebo interakce. ProzkoumatJak specifické látky regulují vnitřní procesy, výzkumníci obvykle vyžadují prostředky k výrobě funkčních sloučenin, které jsou zajímavé a užitečné.
Vzhledem k velikosti a složitosti proteinů není chemická syntéza pro toto úsilí schůdná. Místo toho se živé buňky a jejich buněčný aparát obvykle používají jako továrny na vytváření a konstrukci látek na základě poskytnutých genetických šablon. Rekombinantní proteinový expresní systém pak generuje nezbytnou strukturu k vytvoření léku. Následuje výběr potřebného materiálu pro různé kategorie drog.
Na rozdíl od proteinů lze DNA snadno konstruovat synteticky nebo in vitro pomocí dobře zavedených rekombinantních technik. Proto mohou být DNA templáty specifických genů, s nebo bez přidaných reportérových sekvencí nebo sekvencí afinitních značek, navrženy jako templáty pro expresi sledované látky. Takové sloučeniny odvozené z takových templátů DNA se nazývají rekombinantní proteiny.
Tradiční strategie pro expresi látky zahrnují transfekci buněk vektorem DNA, který obsahuje templát, a poté kultivaci buněk za účelem transkripce a translace požadovaného proteinu. Typicky se buňky poté lyžují, aby se extrahovala exprimovaná sloučenina pro následnou purifikaci. Rekombinantní protein CFP10-ESAT6 je takto zpracován a prochází purifikačním systémem z možnýchtvorba toxinů. Teprve poté jde syntetizovat do vakcíny.
Prokaryotické i eukaryotické in vivo expresní systémy pro molekulární látky jsou široce používány. Volba systému závisí na typu proteinu, požadavku na funkční aktivitu a požadovaném výtěžku. Tyto expresní systémy zahrnují savce, hmyz, kvasinky, bakterie, řasy a buňky. Každý systém má své výhody a výzvy a výběr správného systému pro konkrétní aplikaci je důležitý pro úspěšné vyjádření zkoumané látky.
Výraz od savců
Použití rekombinantních proteinů umožňuje vývoj vakcín a léků různých úrovní. K tomu lze použít tento způsob získávání látky. Savčí expresní systémy mohou být použity k produkci proteinů z živočišné říše, které mají nejpřirozenější strukturu a aktivitu díky jejich fyziologicky relevantnímu prostředí. To má za následek vysokou úroveň posttranslačního zpracování a funkční aktivity. Savčí expresní systémy mohou být použity k produkci protilátek, komplexních proteinů a sloučenin pro použití ve funkčních testech na bázi buněk. Tyto výhody jsou však spojeny s přísnějšími kultivačními podmínkami.
Savčí expresní systémy mohou být použity ke generování proteinů přechodně nebo prostřednictvím stabilních buněčných linií, kde je expresní konstrukt integrován do hostitelského genomu. Zatímco takové systémy lze použít ve více experimentech, časvýroba může generovat velké množství látky za jeden až dva týdny. Tento typ biotechnologie rekombinantních proteinů je velmi žádaný.
Tyto přechodné, vysoce výnosné savčí expresní systémy používají suspenzní kultury a mohou poskytnout gramy na litr. Kromě toho mají tyto proteiny ve srovnání s jinými expresními systémy více přirozeného skládání a posttranslačních modifikací, jako je glykosylace.
Výraz hmyzu
Metody pro produkci rekombinantního proteinu nejsou omezeny na savce. Existují také produktivnější způsoby z hlediska výrobních nákladů, i když výtěžnost látky na 1 litr upravované kapaliny je mnohem nižší.
Hmyzí buňky mohou být použity k expresi vysoké hladiny proteinu s modifikacemi podobnými savčím systémům. Existuje několik systémů, které lze použít k vytvoření rekombinantního bakuloviru, který pak lze použít k extrakci zájmové látky v hmyzích buňkách.
Exprese rekombinantních proteinů lze snadno zvětšit a přizpůsobit suspenzní kultuře s vysokou hustotou pro skládání molekul ve velkém měřítku. Jsou více funkčně podobné přirozenému složení hmoty savců. Ačkoli výtěžek může být až 500 mg/l, produkce rekombinantního bakuloviru může být časově náročná a kultivační podmínky jsou obtížnější než prokaryotické systémy. Nicméně v jižnějších a teplejších zemích je to podobnémetoda je považována za efektivnější.
Bakteriální projev
Produkci rekombinantních proteinů lze zajistit pomocí bakterií. Tato technologie se výrazně liší od výše popsaných. Bakteriální proteinové expresní systémy jsou oblíbené, protože bakterie se snadno kultivují, rychle rostou a poskytují vysoké výtěžky rekombinantní formulace. Vícedoménové eukaryotické látky exprimované v bakteriích jsou však často nefunkční, protože buňky nejsou vybaveny k provádění nezbytných posttranslačních modifikací nebo molekulárního skládání.
Kromě toho se mnoho proteinů stává nerozpustných jako inkluzní molekuly, které je velmi obtížné získat zpět bez drsných denaturátorů a následných těžkopádných postupů opětovného skládání molekul. Tato metoda je většinou považována za stále převážně experimentální.
Vyjádření bez buněk
Rekombinantní protein obsahující aminokyselinovou sekvenci stafylokinázy se získává mírně odlišným způsobem. Je součástí mnoha typů injekcí, které před použitím vyžadují několik systémů.
Cell free protein expression je in vitro syntéza látky za použití translačně kompatibilních celobuněčných extraktů. Extrakty celých buněk v zásadě obsahují všechny makromolekuly a složky potřebné pro transkripci, translaci a dokonce i posttranslační modifikaci.
Tyto složky zahrnují RNA polymerázu, regulační proteinové faktory, transkripční formy, ribozomy a tRNA. Při přidáváníkofaktory, nukleotidy a specifický genový templát mohou tyto extrakty syntetizovat požadované proteiny během několika hodin.
Ačkoli to není udržitelné pro velkovýrobu, bezbuněčné nebo in vitro proteinové expresní systémy (IVT) nabízejí řadu výhod oproti konvenčním in vivo systémům.
Bezbuněčná exprese umožňuje rychlou syntézu rekombinantních přípravků bez použití buněčné kultury. Bezbuněčné systémy umožňují značit proteiny modifikovanými aminokyselinami a také exprimovat sloučeniny, které podléhají rychlé proteolytické degradaci intracelulárními proteázami. Navíc je snazší exprimovat mnoho různých proteinů současně pomocí bezbuněčné metody (například testování proteinových mutací expresí v malém měřítku z mnoha různých templátů rekombinantní DNA). V tomto reprezentativním experimentu byl IVT systém použit k expresi lidského proteinu kaspázy-3.
Závěry a vyhlídky do budoucna
Produkci rekombinantních proteinů lze nyní považovat za vyspělou disciplínu. To je výsledkem četných postupných zlepšení v čištění a analýze. V současné době jsou programy objevování léků zřídka zastaveny kvůli neschopnosti produkovat cílový protein. Paralelní procesy pro expresi, čištění a analýzu několika rekombinantních látek jsou nyní dobře známé v mnoha laboratořích po celém světě.
Proteinové komplexy a rostoucí úspěch ve výroběsolubilizované membránové struktury budou vyžadovat více změn, aby udržely krok s poptávkou. Vznik efektivních smluvních výzkumných organizací pro pravidelnější dodávky bílkovin umožní přerozdělení vědeckých zdrojů, aby bylo možné těmto novým výzvám čelit.
Paralelní pracovní postupy by navíc měly umožnit vytvoření kompletních knihoven sledované látky, aby bylo možné identifikovat nové cíle a pokročilý screening, spolu s tradičními projekty objevování léčiv s malými molekulami.
