Moderní biologie udivuje jedinečností a rozsahem svých objevů. Dnes tato věda studuje většinu procesů, které jsou našim očím skryty. To je pozoruhodné pro molekulární biologii – jednu ze slibných oblastí, která pomáhá odhalit nejsložitější záhady živé hmoty.
Co je zpětný přepis
Reverzní transkripce (zkráceně RT) je specifický proces charakteristický pro většinu RNA virů. Jeho hlavním rysem je syntéza dvouvláknové molekuly DNA založené na messenger RNA.
OT není charakteristické pro bakterie nebo eukaryotické organismy. Hlavní enzym, reverzní enzym, hraje klíčovou roli při syntéze dvouvláknové DNA.
Historie objevů
Myšlenka, že by se molekula ribonukleové kyseliny mohla stát šablonou pro syntézu DNA, byla až do 70. let minulého století považována za absurdní. Pak B altimore a Temin, pracující odděleně od sebe, téměř současně objevili nový enzym. Říkali tomu RNA-dependentní-DNA polymeráza nebo reverzní transkriptáza.
Objev tohoto enzymu bezpodmínečně potvrdil existenci organismůschopné reverzní transkripce. Oba vědci obdrželi v roce 1975 Nobelovu cenu. Po nějaké době Engelhardt navrhl alternativní název pro reverzní transkriptázu - revertáza.
Proč OT odporuje ústřednímu dogmatu molekulární biologie
Centrální dogma je koncept sekvenční syntézy proteinů v jakékoli živé buňce. Takové schéma se skládá ze tří složek: DNA, RNA a proteinu.
Podle centrálního dogmatu lze RNA syntetizovat výhradně na templátu DNA a teprve poté se RNA podílí na budování primární struktury proteinu.
Toto dogma bylo oficiálně přijato ve vědecké komunitě před objevem reverzní transkripce. Není divu, že myšlenka reverzní syntézy DNA z RNA byla vědci dlouho odmítnuta. Teprve v roce 1970, spolu s objevem reverzace, byl tento problém ukončen, což se odrazilo v konceptu syntézy proteinů.
Vrácení ptačích retrovirů
Proces reverzní transkripce není úplný bez účasti RNA-dependentní-DNA polymerázy. Revertáza ptačího retroviru byla dosud studována v maximálním rozsahu.
V jednom virionu této rodiny virů lze nalézt pouze asi 40 molekul tohoto proteinu. Protein se skládá ze dvou podjednotek, které jsou ve stejném počtu a vykonávají tři důležité funkce reverzace:
1) Syntéza molekuly DNA jak na templátu jednovláknové/dvouvláknové RNA, tak na bázi deoxyribonukleových kyselin.
2) Aktivace RNázy H, jejíž hlavní úlohou ještěpení molekuly RNA v komplexu RNA-DNA.
3) Zničení úseků molekul DNA pro vložení do eukaryotického genomu.
Mechanismus OT
Kroky zpětné transkripce se mohou lišit v závislosti na rodině virů, tzn. na typu jejich nukleových kyselin.
Pojďme nejprve zvážit ty viry, které využívají reversetase. Zde je proces OT rozdělen do 3 kroků:
1) Syntéza „-“RNA vlákna na šabloně „+“RNA vlákna.
2) Destrukce „+“řetězce RNA v komplexu RNA-DNA pomocí enzymu RNázy H.
3) Syntéza molekuly dvouvláknové DNA na templátu "-" řetězce RNA.
Tento způsob reprodukce virionů je typický pro některé onkogenní viry a virus lidské imunodeficience (HIV).
Za zmínku stojí, že pro syntézu jakékoli nukleové kyseliny na templátu RNA je zapotřebí semeno nebo primer. Primer je krátká sekvence nukleotidů, která je komplementární k 3' konci molekuly RNA (šablony) a hraje důležitou roli při zahájení syntézy.
Když jsou hotové molekuly dvouvláknové DNA virového původu integrovány do eukaryotického genomu, spustí se obvyklý mechanismus syntézy virionových proteinů. V důsledku toho se buňka „zajatá“virem stává továrnou na výrobu virionů, kde se ve velkém množství tvoří potřebné molekuly proteinu a RNA.
Další způsob reverzní transkripce je založen na působení RNA syntetázy. Tento protein je aktivní u paramyxovirů, rhabdovirů, pikornovirů. V tomto případě neexistuje třetí stupeň SZ – formacedvouvláknová DNA a místo toho je na templátu virového řetězce RNA „-“syntetizován „+“řetězec RNA a naopak.
Opakování takových cyklů vede jak k replikaci virového genomu, tak k tvorbě mRNA schopné syntézy proteinů v podmínkách infikované eukaryotické buňky.
Biologický význam reverzní transkripce
Proces OT má prvořadý význam v životním cyklu mnoha virů (především retrovirů, jako je HIV). RNA virionu, který napadl eukaryotickou buňku, se stává templátem pro syntézu prvního řetězce DNA, na kterém není obtížné dokončit druhý řetězec.
Získaná dvouvláknová DNA viru je integrována do eukaryotického genomu, což vede k aktivaci procesů syntézy virionových proteinů a vzniku velkého počtu jeho kopií uvnitř infikované buňky. Toto je hlavní poslání Revertase a OT obecně pro virus.
Reverzní transkripce může také nastat u eukaryot v kontextu retrotranspozonů - mobilních genetických elementů, které se mohou nezávisle transportovat z jedné části genomu do druhé. Takové prvky podle vědců způsobily evoluci živých organismů.
Retrotransposon je úsek eukaryotické DNA, který kóduje několik proteinů. Jeden z nich, reversetase, se přímo podílí na delokalizaci takového retrotransporozonu.
Využití OT ve vědě
Od chvíle, kdy byla reverzní transkripce izolována ve své čisté formě, přijali biologové proces reverzní transkripce. Studium mechanismu OT stále pomáhá číst sekvence nejdůležitějších lidských proteinů.
Faktem je, že genom eukaryot, včetně nás, obsahuje neinformativní oblasti zvané introny. Když se z takové DNA přečte nukleotidová sekvence a vytvoří se jednovláknová RNA, tato ztratí introny a kóduje výhradně protein. Pokud je DNA syntetizována pomocí reverzace na RNA templátu, je snadné ji sekvenovat a zjistit pořadí nukleotidů.
Nukleová kyselina, která byla vytvořena reverzní transkriptázou, se nazývá cDNA. Často se používá v polymerázové řetězové reakci (PCR) k umělému zvýšení počtu kopií výsledné kopie cDNA. Tato metoda se používá nejen ve vědě, ale také v medicíně: laboranti určují podobnost takové DNA s genomy různých bakterií nebo virů ze společné knihovny. Syntéza vektorů a jejich zavádění do bakterií je jednou z perspektivních oblastí biologie. Pokud se RT použije k vytvoření DNA lidí a jiných organismů bez intronů, mohou být takové molekuly snadno zavedeny do bakteriálního genomu. Ty se tak stávají továrnami na výrobu látek nezbytných pro člověka (například enzymů).
