Buněčná kultura je vysoce závislá na podmínkách. Liší se pro každý typ buňky, ale obvykle se skládají z vhodné nádoby se substrátem nebo médiem, které poskytuje potřebné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), růstové faktory, hormony a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzičku. -chemické prostředí (pH pufru, osmotický tlak, teplota). Většina buněk vyžaduje povrchový nebo umělý substrát (adhezivní nebo jednovrstvá kultura), zatímco jiné lze volně množit v kultivačním médiu (suspenzní kultura). Životnost většiny buněk je dána geneticky, ale některé buněčné kultury byly přeměněny na nesmrtelné buňky, které se budou množit donekonečna, pokud budou vytvořeny optimální podmínky.
Definice
Sdefinice je zde velmi jednoduchá. V praxi se termín "buněčná kultura" nyní týká kultivace buněk pocházejících z mnohobuněčných eukaryot, zejména živočišných buněk, na rozdíl od jiných typů kultur. Historický vývoj a kultivační metody úzce souvisí s tkáňovou a orgánovou kulturou. Virová kultura je také spojena s buňkami jako hostiteli virů.
Historie
Laboratorní techniky pro získávání a kultivaci buněk separovaných z původního tkáňového zdroje se v polovině 20. století staly robustnějšími. Hlavní průlomy v této oblasti učinili vědci z Yale University.
Přelom v polovině století
Původně bylo získávání a kultivace buněk praktikováno s cílem nalézt všelék na mnoho nebezpečných virů. Řada výzkumníků zjistila, že mnoho kmenů virů může bezpečně žít, prosperovat a množit se na uměle vypěstovaných živočišných buňkách nebo dokonce celých orgánech, které jsou drženy autonomně ve speciálních baňkách. K takovým testům se zpravidla používají buňky orgánů zvířat, které jsou co nejblíže člověku - například vyšších primátů, jako jsou šimpanzi. Všechny tyto objevy byly učiněny ve 40. letech 20. století, kdy byly experimenty na lidech z určitých důvodů nejrelevantnější.
Metodika
Buňky lze izolovat z tkání pro ex vivo kultivaci několika způsoby. Mohou být snadno zbaveny krve, ale pouze bílé krvinky jsou schopny růstu v kultuře. Buňky mohoubýt izolovány z pevných tkání štěpením extracelulární matrice pomocí enzymů, jako je kolagenáza, trypsin nebo pronáza, před protřepáním tkáně, aby se buňky uvolnily do suspenze. Alternativně mohou být kousky tkáně umístěny do růstového média a buňky, které rostou, jsou dostupné pro kultivaci. Tato metoda je známá jako kultivace explantátu.
Buňky, které jsou kultivovány přímo od subjektu, jsou známé jako primární buňky. S výjimkou některých pocházejících z nádorů má většina primárních buněčných kultur omezenou životnost.
Nesmrtelní a kmenové buňky
Ustavená nebo imortalizovaná buněčná linie získala schopnost neomezené reprodukce, buď náhodnou mutací nebo záměrnou modifikací, jako je umělá exprese genu telomerasy. Jako typické buněčné typy jsou dobře známé četné buněčné linie.
Hromadná kultivace živočišných buněčných linií je zásadní pro výrobu virových vakcín a dalších biotechnologických produktů. Kultura lidských kmenových buněk se používá k rozšíření jejich počtu a diferenciaci buněk na různé typy vhodné k transplantaci. Kultura lidských (kmenových) buněk se také používá ke sběru molekul a exozomů uvolněných kmenovými buňkami pro terapeutické účely.
Spojení s genetikou
Biologické produkty vyrobené technologií rekombinantní DNA (rDNA) ve zvířecích kulturách zahrnujíenzymy, syntetické hormony, imunobiologická (monoklonální protilátky, interleukiny, lymfokiny) a protirakovinná činidla. Zatímco mnoho jednodušších proteinů může být vyrobeno pomocí rDNA v bakteriálních kulturách, složitější proteiny, které jsou glykosylované (modifikované sacharidy), musí být v současné době vyrobeny v živočišných buňkách.
Důležitým příkladem takového komplexního proteinu je hormon erytropoetin. Náklady na pěstování savčích buněčných kultur jsou vysoké, proto probíhá výzkum na vytvoření takto komplexních proteinů v hmyzích buňkách nebo ve vyšších rostlinách. Jednou z aplikací je použití jednotlivých embryonálních buněk a somatických embryí jako zdroje přímého přenosu genů bombardováním částicemi, expresí přechodných genů a konfokální mikroskopií. Kultura rostlinných buněk je nejběžnější formou této praxe.
Tkáňové kultury
Tkáňová kultura je kultivace tkání nebo buněk oddělených od organismu. Tento proces je obvykle usnadněn použitím kapalného, polotuhého nebo pevného růstového média, jako je bujón nebo agar. Tkáňová kultura obecně označuje kulturu živočišných buněk a tkání, přičemž specifičtější termín se používá pro rostliny, rostlinné buňky a tkáňové kultury. Termín „tkáňová kultura“zavedl americký patolog Montrose Thomas Burroughs.
Historie tkáňové kultury
V roce 1885 odstranil Wilhelm Roux část dřeněmisky fetálního kuřete a udržovaly je v teplém solném roztoku po několik dní, čímž se stanovil základní princip tkáňové kultury. V roce 1907 prokázal zoolog Ross Granville Harrison růst embryonálních žabích buněk, které by daly vzniknout nervovým buňkám ve sražené lymfě. V roce 1913 kultivovali E. Steinhardt, C. Israel a R. A. Lambert virus vakcínie ve fragmentech tkáně rohu morčete. Už to bylo něco mnohem pokročilejšího než kultivace rostlinných buněk.
Z minulosti do budoucnosti
Gotlieb Haberlandt jako první poukázal na možnost kultivace izolovaných rostlinných tkání. Navrhl, že tato metoda by mohla určit schopnosti jednotlivých buněk prostřednictvím tkáňové kultury a také vzájemné ovlivňování tkání na sebe. Jak byla realizována původní Haberlandova tvrzení, začaly se aktivně uplatňovat techniky tkáňových a buněčných kultur, což vedlo k novým objevům v biologii a medicíně. Jeho původní myšlenka, představená v roce 1902, se jmenovala totipotencialita: "Teoreticky jsou všechny rostlinné buňky schopny produkovat kompletní rostlinu." Kultivace buněčných kultur v té době dramaticky pokročila.
V moderním použití tkáňová kultura obecně označuje růst buněk z tkáně mnohobuněčného organismu in vitro. Podmínky buněčné kultivace nejsou v tomto případě příliš důležité. Tyto buňky mohou být izolovány z dárcovského organismu, primárních buněk nebo imortalizované buněčné linie. Buňky se promývajíkultivační médium, které obsahuje živiny a zdroje energie nezbytné pro jejich přežití. Termín "tkáňová kultura" se často používá zaměnitelně s buněčnou kulturou.
Aplikace
Doslovný význam tkáňové kultury se týká kultivace kousků tkáně, tj. explantátové kultury.
Tkáňové kultury jsou důležitým nástrojem pro studium biologie buněk mnohobuněčných organismů. Poskytuje in vitro tkáňový model v dobře definovaném prostředí, se kterým lze snadno manipulovat a analyzovat.
V živočišné tkáňové kultuře mohou být buňky pěstovány jako 2D monovrstvy (konvenční kultura) nebo uvnitř vláknitých skeletů či gelů, aby bylo dosaženo přirozenějších 3D tkáňových struktur (3D kultura). Eric Simon ve zprávě o grantu NIH SBIR z roku 1988 ukázal, že elektrostatické zvlákňování by mohlo být použito k výrobě polymerových vláken v nano- a submikronovém měřítku speciálně navržených pro použití jako buněčné a tkáňové substráty in vitro.
Toto rané použití mřížek z elektricky vodivých vláken pro buněčné kultury a tkáňové inženýrství ukázalo, že různé typy buněk přilnou a proliferují na polykarbonátových vláknech. Bylo pozorováno, že na rozdíl od zploštělé morfologie typicky pozorované ve 2D kultuře, buňky pěstované na vláknech elektrického kabelu vykazují zaoblenější 3D morfologii typicky pozorovanou v tkáních in vivo.
Kulturazejména rostlinná tkáň je spojena s pěstováním celých rostlin z malých kousků rostlinných vláken kultivovaných v médiu.
Rozdíly v modelech
Výzkum v oblasti tkáňového inženýrství, kmenových buněk a molekulární biologie primárně zahrnuje pěstování buněčných kultur na plochých plastových miskách. Tato metoda je známá jako dvourozměrná (2D) buněčná kultura a byla poprvé vyvinuta Wilhelmem Rouxem, který v roce 1885 odstranil část dřeňové destičky embryonálního kuřete a ponechal ji několik dní v teplém fyziologickém roztoku na plochém skle.
Z pokroku v technologii polymerů se objevila moderní standardní plastová miska pro dvourozměrné buněčné kultury, běžně známá jako Petriho miska. Julius Richard Petri, německý bakteriolog, obvykle uváděný ve vědecké literatuře jako vynálezce tohoto vynálezu, pracoval jako asistent Roberta Kocha. Dnes různí výzkumníci také používají kultivační baňky, kužely a dokonce i jednorázové sáčky, jaké se používají v jednorázových bioreaktorech.
Kromě kultivace dobře zavedených imortalizovaných buněčných linií lze po omezenou dobu kultivovat buňky z primárních explantátů mnoha organismů, dokud se neobjeví citlivost. Kultivované primární buňky byly široce používány ve výzkumu, jako v případě rybích keratocytů ve studiích buněčné migrace. Ve většině lze použít buněčná kultivační médiajiný.
Kultury rostlinných buněk se obvykle pěstují jako buněčné suspenzní kultury v tekutém médiu nebo v kalusových kulturách na pevném médiu. Kultura nediferencovaných rostlinných buněk a kalusů vyžaduje správnou rovnováhu rostlinných růstových hormonů auxinu a cytokininu.
