Absorpce a další reemise světla anorganickými a organickými médii je výsledkem fosforescence nebo fluorescence. Rozdíl mezi jevy je délka intervalu mezi absorpcí světla a emisí proudu. S fluorescencí probíhají tyto procesy téměř současně a s fosforescencí s určitým zpožděním.
Historické pozadí
V roce 1852 britský vědec Stokes poprvé popsal fluorescenci. Tento nový termín vytvořil jako výsledek svých experimentů s kazivec, který při vystavení ultrafialovému světlu vyzařoval červené světlo. Stokes zaznamenal zajímavý fenomén. Zjistil, že vlnová délka fluorescenčního světla je vždy delší než vlnová délka excitačního světla.
V 19. století bylo provedeno mnoho experimentů k potvrzení hypotézy. Ukázali, že různé vzorky fluoreskují, když jsou vystaveny ultrafialovému světlu. Mezi materiály patřily mimo jiné krystaly, pryskyřice, minerály, chlorofyl,léčivé suroviny, anorganické sloučeniny, vitamíny, oleje. Přímé použití barviv pro biologickou analýzu začalo až v roce 1930
Popis fluorescenční mikroskopie
Některé materiály používané při výzkumu v první polovině 20. století byly vysoce specifické. Díky indikátorům, kterých nebylo možné dosáhnout kontrastními metodami, se metoda fluorescenční mikroskopie stala důležitým nástrojem v biomedicínském i biologickém výzkumu. Získané výsledky byly neméně důležité pro vědu o materiálech.
Jaké jsou výhody fluorescenční mikroskopie? S pomocí nových materiálů bylo možné izolovat vysoce specifické buňky a submikroskopické komponenty. Fluorescenční mikroskop umožňuje detekovat jednotlivé molekuly. Různé barvy umožňují identifikovat několik prvků současně. Přestože je prostorové rozlišení zařízení omezeno difrakčním limitem, který zase závisí na specifických vlastnostech vzorku, detekce molekul pod touto úrovní je také docela možná. Různé vzorky vykazují po ozáření autofluorescenci. Tento jev je široce používán v petrologii, botanice, polovodičovém průmyslu.
Funkce
Studium živočišných tkání nebo patogenních mikroorganismů je často komplikováno buď příliš slabou, nebo velmi silnou nespecifickou autofluorescencí. Nicméně hodnota vvýzkum získává zavádění do materiálu součástek buzených na specifické vlnové délce a emitujících světelný tok požadované intenzity. Fluorochromy působí jako barviva schopná samopřichycení ke strukturám (neviditelným nebo viditelným). Zároveň se vyznačují vysokou selektivitou s ohledem na cíle a kvantový výnos.
Fluorescenční mikroskopie se začala široce používat s příchodem přírodních a syntetických barviv. Měly specifické profily intenzity vyzařování a excitace a byly zaměřeny na specifické biologické cíle.
Identifikace jednotlivých molekul
Často za ideálních podmínek můžete zaregistrovat záři jediného prvku. K tomu je mimo jiné nutné zajistit dostatečně nízký šum detektoru a optické pozadí. Molekula fluoresceinu může emitovat až 300 000 fotonů před zničením v důsledku fotobělení. S 20% mírou sběru a efektivitou procesu je lze zaregistrovat v částce cca 60 tisíc
Fluorescenční mikroskopie založená na lavinových fotodiodách nebo násobení elektronů umožnila výzkumníkům pozorovat chování jednotlivých molekul po dobu sekund a v některých případech i minut.
Potíže
Klíčovým problémem je potlačení šumu z optického pozadí. Vzhledem k tomu, že mnoho materiálů používaných při konstrukci filtrů a čoček vykazuje určitou autofluorescenci, bylo úsilí vědců v počátečních fázích zaměřeno na vydáníkomponenty s nízkou fluorescencí. Následné experimenty však vedly k novým závěrům. Zejména bylo zjištěno, že fluorescenční mikroskopie založená na úplném vnitřním odrazu dosahuje nízkého pozadí a vysokého excitačního světelného výkonu.
Mechanismus
Principy fluorescenční mikroskopie založené na úplném vnitřním odrazu spočívají v použití rychle se rozpadajících nebo nešířících se vln. Vzniká na rozhraní mezi médii s různými indexy lomu. V tomto případě světelný paprsek prochází hranolem. Má vysoký index lomu.
Prizma sousedí s vodným roztokem nebo sklem s nízkými parametry. Pokud je paprsek světla namířen pod úhlem, který je větší než kritický, paprsek se zcela odráží od rozhraní. Tento jev zase dává vzniknout vlně, která se nešíří. Jinými slovy, vzniká elektromagnetické pole, které proniká médiem s nižším indexem lomu ve vzdálenosti menší než 200 nanometrů.
V nešířící se vlně bude intenzita světla zcela dostatečná k vybuzení fluoroforů. Vzhledem k výjimečně malé hloubce však bude její objem velmi malý. Výsledkem je pozadí nízké úrovně.
Úprava
Fluorescenční mikroskopii založenou na úplném vnitřním odrazu lze realizovat s epiiluminací. To vyžaduje čočky se zvýšenou numerickou aperturou (alespoň 1,4, ale je žádoucí, aby dosahovala 1,45-1,6), a také částečně osvětlené pole přístroje. Toho posledního je dosaženo malým bodem. Pro větší rovnoměrnost je použit tenký prstenec, kterým je část průtoku blokována. K získání kritického úhlu, po kterém dojde k úplnému odrazu, je zapotřebí vysoká úroveň lomu imerzního média v čočkách a krycím skle mikroskopu.
