V diferenciálním stanovení enterobakterií a některých vibrií zaujímá zvláštní místo Voges-Proskauerova reakce. Test je založen na schopnosti bakterií fermentovat glukózu za vzniku acetoinu.
Podstata výzkumného procesu
V mikrobiologii se Voges-Proskauerova reakce často používá k odlišení enterobakterií v rámci rodiny Yersinia (včetně patogenů pseudotuberkulózy a enterokolitidy), Escherichia coli a sporotvorných aerobů. Výsledek je vizualizován obarvením média po přidání určitých činidel.
Tento test patří do řady IMViC (zkratka Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - skupina identifikačních testů včetně diferenciálních definic:
- s indolem, na základě rozkladu tryptofanu na indol, použitého v přítomnosti Kovacsova nebo Ehrlichova činidla;
- použitímethylroth neboli methylová červeň, která detekuje dané pH v důsledku metabolizace glukózy;
- Voges-Proskauerovy reakce pro detekci acetyl-methylkarbinolu;
- využití citrátu se změnou barvy v důsledku alkalizace média.
Podstatou procesu je vizualizace přítomnosti diagnostikovaných bakterií v důsledku interakce jimi tvořeného acetoinu s hydroxidem draselným za přítomnosti kyslíku. Acetyl-methylkarbinol se oxiduje na diacetyl, který tvoří jasně červenou nebo růžovou sloučeninu. Zvyšte citlivost testu zavedením alfa-naftolu před přidáním hydroxidu draselného.
Nastavení testu
Formulace Voges-Proskauerovy reakce zahrnuje předběžnou kultivaci mikroorganismů. Na Clarkovo diferenciálně diagnostické médium se vysévá čistá kultura, jejíž variantou je Clarkův bujón (bez přídavku agaru-agaru). Použije se buď hotové médium, nebo se připraví nezávisle. Ingredience zahrnují:
- 5g peptonu;
- 5g glukózy;
- 5g hydrogenfosforečnanu draselného;
- 1l destilát.
Během studie je kultura naočkována sterilní bakteriologickou kličkou do tekutého média. Množství - 5 ml ve zkumavce plus kontrola. Inkubace se provádí při teplotě 35-37 stupňů po dobu dvou dnů. Dále se provádí studie Voges-Proskauerovy reakce ve fázích:
- 2, 5 ml bujónové kultury se přenese do sterilní zkumavky.
- Přidejte šest kapek alfa-naftolu (5% roztok alkoholu).
- Přidat 40 %roztok louhu draselného v množství 0,1 ml nebo dvě kapky.
- Míchání se provádí jemným třepáním zkumavky.
- Vyhodnoťte výsledek po 15 minutách od začátku experimentu.
Alternativní testovací metodou je inkubace přes noc, jejíž doba je zkrácena na 18 hodin nebo až na jeden den. Kromě této metody se používá také expresní test: kultura se vloží ve smyčce do 2 ml média, inkubuje se asi čtyři hodiny, poté se přidají reagencie ve stejném množství 2-3 kapky, promíchá se a výsledek je vyhodnocen po deseti minutách.
Kontrola je jedním z původců pneumonie Klebsiella pneumoniae - kmen atcc 13883.
Vyhodnocení výsledku
Po požadované době po přidání činidel (od 5 do 15 minut) by měla být pozorována třešňově červená barva s výraznou pozitivní reakcí, červená a růžová - se slabou pozitivní reakcí. Žádná změna není zaznamenána jako negativní výsledek.
Přebytek hydroxidu draselného v roztoku může způsobit napodobení pozitivní reakce, zbarvení do měděné barvy. V tomto případě by měla být zaznamenána negativní odpověď testovaného včelstva. Také barvení mědí se objevuje v případech, kdy se hodnocení provádí hodinu po zavedení reagencií.
Při hodnocení výsledku je třeba vzít v úvahu, že delší kultivace studovaných mikroorganismů (více než tři dny) vede k okyselení média, což může vést k nesprávnému výsledku studie. Reakce může být mírně pozitivní popřfalešně negativní.
Požadavky na testovací činidla
Voges-Proskauerova činidla musí splňovat požadavky, jako je správná koncentrace, vysoká čistota a stabilita, kterých je dosaženo správným skladováním.
Testovací soupravy připravené k použití obvykle obsahují činidla pro 100 nebo více použití a dodávají se v plastových lahvičkách nebo lahvičkách z tónovaného skla. Kvalita je regulována příslušnou dokumentací.
