Kultivace bakterií: metody, principy, kroky a podmínky

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Naposledy změněno: 2023-12-17 05:20

Mikroorganismy v přírodě kolem nás jsou všude: v půdách, vodních plochách, na površích různých předmětů, obývají jimi lidé i zvířata. To vše může sloužit jako zdroje mikrobiální kontaminace potravin, léků a výrobních linek. Kultivace bakterií je nezbytná pro studium jejich vlastností, potřeb a charakteristik. To je zase důležitý krok ve vývoji různých léků, laboratorní diagnostice nemocí, výpočtu výrobních reaktorů a mnoha dalších.

Obecné pojmy

Kultivací bakterií se v mikrobiologii rozumí kultivace mikroorganismů prováděná v laboratoři. Mikroby, které vyrostly na vybraném živném médiu, se zase nazývají kultura. Kultury mohou být smíšené, pokud jsou tvořeny různými typy mikroorganismů, a čisté, pokud jsou zastoupeny pouze jedním typem bakterií.

Pokud jde o výživuDo média je umístěna pouze jedna buňka a v důsledku její reprodukce se získá skupina jedinců, pak se tato sada mikroorganismů nazývá klon. Když se klon vyvine do bodu, kdy se stane viditelným pouhým okem, tato sbírka bakterií se nazývá kolonie.

Kultivace bakterií izolovaných z různých zdrojů se obvykle provádí odděleně od sebe. Každá taková samostatně pěstovaná skupina mikrobů se nazývá kmen. Pokud je tedy jeden typ stafylokoka izolován ze tří zdrojů (nebo různých částí stejného produktu, různých lidí), hovoří se o třech kmenech tohoto typu stafylokoka.

Růstové faktory bakterií

Zahrnují různé aminokyseliny, lipidy, purinové báze a další sloučeniny nezbytné pro vývoj mikroorganismů. Někteří mikrobi mohou samostatně produkovat látky, které potřebují, zatímco jiní je potřebují přijímat v hotové formě. Podle potřeb mikroorganismů v určitých růstových faktorech se provádí identifikace a diferenciace bakterií. Také tento parametr je důležitý pro správnou přípravu živného média pro laboratorní a biotechnologické práce:

Aminokyseliny. Bakterie mohou vyžadovat jednu konkrétní aminokyselinu nebo skupinu kyselin. Klostridie tedy potřebují leucin a tyrosin, streptokoky potřebují leucin a arginin. Mikroorganismy, které ke svému růstu potřebují aminokyseliny zvenčí, se nazývají auxotrofy.
Purinové a pyrimidinové báze a také jejich deriváty (adenin, guanin a další). Jsou důležitým faktorem růstu mnohaDruh Streptococcus.
Vitamíny. Jsou součástí koenzymů vyžadovaných bakteriemi. Takže kyselinu nikotinovou, stejně jako její amid, které jsou součástí NAD a NADP, potřebují záškrt a korynebakterie shigella. Thiamin, jako integrální součást pyrofosfátu, vyžadují Staphylococcus aureus, pneumokoky, brucella. Kyselinu pantotenovou, která je součástí koenzymu CoA, vyžadují tetanové bacily a některé druhy streptokoků. Cytochromy, a tedy kyselina listová, hemy a biotin, které je tvoří, jsou nezbytné pro Mycobacterium tuberculosis a Haemophilus influenzae.

Požadavky na životní prostředí

Podmínky pro kultivační média pro kultivaci bakterií:

Výživa. Musí obsahovat látky, navíc v lehce stravitelné formě, nezbytné pro výživu a doplnění energie mikroorganismy. Patří mezi ně organogeny a minerály. Některé mikroorganismy navíc vyžadují vitamíny a aminokyseliny, které si neumí syntetizovat.
Optimální úroveň pH. Ovlivňuje propustnost buněčné membrány a tím i schopnost bakterií absorbovat živiny. Nejčastěji by hodnota pH měla být na úrovni 7, 2–7, 4. Mnoho mikroorganismů v průběhu svého života produkuje produkty s kyselými nebo zásaditými reakcemi, a aby se pH živného média neměnilo, musí být ve vyrovnávací paměti.
Izotonický. Osmotický tlak v živném médiu pro kultivaci bakterií by měl mít stejné hodnoty jakouvnitř mikrobiálních buněk. Obvykle odpovídá 0,5% roztoku NaCl.
Sterilita. To je způsobeno skutečností, že výskyt cizích bakterií zkreslí výsledky studie analyzovaného kmene.
Úroveň vlhkosti. Tento indikátor spolu s konzistencí média by měl mít optimální vlastnosti pro konkrétní typ bakterií.
Redoxní potenciál (RH2). Ukazuje poměr látek, které elektrony darují a přijímají, a také úroveň nasycení živného média kyslíkem. U aerobů a anaerobů se podmínky pro kultivaci bakterií v tomto ukazateli poněkud liší. Anaerobní mikroorganismy se nejlépe reprodukují při hodnotách RH2 pod 5 a aerobní mikroorganismy alespoň 10.
Uniformita. Je důležité, aby kultivační médium obsahovalo konstantní množství jednotlivých složek. Kromě toho jsou preferována čirá řešení, která usnadňují sledování růstu plodin nebo zaznamenávání kontaminace.

Typy kultivačních médií

Výběr konkrétního média pro pěstování mikroorganismů je ovlivněn mnoha faktory, mezi které patří charakteristika jejich výživy a účel studie. Hlavní znaky, na nichž je založena klasifikace živných médií, jsou:

1. Komponenty. Podle výchozích látek použitých k vytvoření substrátu rozlišují:

natural, které se připravují z produktů živočišného nebo rostlinného původu (např. maso, mléko, ovoce) a jsou vhodné pro pěstování smíšenýchplodiny;
polosyntetické, ve kterých jsou drahé přírodní potravinářské produkty nahrazovány nepotravinářskými produkty (například kostní moučka, krevní sraženiny) a které jsou optimální pro kultivaci určitých typů bakterií nebo izolaci jejich metabolických produktů od prostředí;
syntetické, které se připravují z přesného množství chemických sloučenin, mají známé konstantní složení a jsou snadno reprodukovatelné.

2. Konzistence (hustota). Rozlišujte prostředí:

liquid;
hustý;
polotekuté.

Poslední dva se připravují ze speciálních roztoků nebo tekutých látek s přídavkem agar-agaru nebo želatiny pro vytvoření požadované hustoty. Kromě toho je hustým prostředím pro růst bakterií sražené krevní sérum, brambory, silikagelová média, karagenan.

3. Sloučenina. Na tomto základě jsou prostředí:

jednoduchý, jehož seznam je krátký, je Meat Peptone Bujón (MBB), Hottinger Bujón a agar, Masový peptonový agar (MPA), výživná želatina a peptonová voda.
komplex, připravovaný z jednoduchých s přídavkem krve, syrovátky, sacharidů a dalších látek.

4. Jmenování. Rozlišují se následující živná média:

main se používají k pěstování mnoha patogenních mikrobů (obvykle jednoduché složení);
speciální se používají k izolaci a kultivaci bakterií, které nerostou na jednoduchých substrátech;
selektivní (jsou také selektivní) jsou vhodné pro izolaci specifického typu bakterií a inhibují růst přidružených mikrobů (selektivitavytvořené přidáním určitých látek do média, jako jsou antibiotika nebo soli, nebo úpravou pH);
diferenciální diagnostika umožňuje odlišit jeden typ bakterií od druhého posouzením enzymatické aktivity, například média;
konzervační látky jsou potřebné pro počáteční očkování s následným transportem vzorků, protože zabraňují smrti mikroorganismů a také inhibují růst jiných bakterií.

Příprava média

Nejdůležitějším krokem při kultivaci anaerobních bakterií je příprava vhodného živného média. Po výběru optimálních parametrů pokračujte následujícími kroky:

vážení výběrem vzorku součástí na analytické váze;
rozpouštění se provádí v destilované vodě zahřáté na 70 °C a odděleně se rozpouštějí fosforečnany, mikro- a makrosoli;
vaření ve vodní lázni po dobu dvou minut;
určení pH pomocí indikačního papírku nebo potenciometru;
filtrace přes mokrou tkaninu nebo papírové filtry pro tekutá i roztavená hustá média a přes filtr z bavlněné gázy pro agarová média;
stáčení prováděno na 3/4 kapacity;
středně závislá sterilizace;
kontrola sterility se provádí usazením na dva dny do termostatu a následným prohlížením;
chemická kontrola ke stanovení pH a obsahu nezbytnéhopoložky;
biologická kontrola zkušebním očkováním.

Sterilizace skla a médií

Jedním ze základních principů kultivace bakterií je sterilita. Růst a vývoj cizích mikroorganismů může ovlivnit vlastnosti živného média změnou jeho chemického složení a pH. Sterilizace je hlavní podmínkou pro pěstování čistých kultur. V praxi se pod tímto pojmem rozumí způsoby ničení naprosto všech forem života na povrchu a v objemu sterilizovaných předmětů. Nádoby, použité nástroje, média a další položky používané během studie jsou sterilizovány.

Některé typy sterilizace:

Zapalování. Sterilizaci smyček a jehel pro výsev, sklíčka, některé nástroje lze provádět pomocí hořáku nebo lihové lampy.
Vaření. Vhodné pro manipulaci se stříkačkami, jehlami, potravinami, ale nezabíjí bakteriální spory.
Sterilizace suchým teplem. Provádí se ve speciální sušicí skříni a je vhodný pro zpracování baněk, zkumavek a dalšího laboratorního skla.
Parní sterilizace. Při provádění v autoklávu je tato metoda vysoce účinná. Není však vhodný pro živná média obsahující proteiny nebo jiné sloučeniny, které se rozkládají při vysokých teplotách. Šetrnější lze nazvat tyndalizací. Provádí se v Kochově kotli a kombinuje klíčení spór s jejich zničením.
Pasterizace. Používá se pro média, která při varu mění své vlastnosti (například mléko, víno, pivo), schopnézbavit je mikroorganismů, které nenesou spory. Teplota zpracování je pouze 50-60 °C po dobu patnácti až třiceti minut. V některých případech se používá sterilizace za studena, která se provádí pomocí filtrů nebo UV paprsků.

Podmínky pěstování bakterií

Růst a vývoj bakterií je možný pouze za určitých faktorů a hodnot každého z nich:

1. Teplota. Existují tři skupiny bakterií, které se liší v preferencích teploty:

termofily neboli teplomilné mikroby rostou při 45-90°C, což znamená, že se nemnoží v lidských a zvířecích organismech;
psychrofilové neboli chladnomilné mikroorganismy preferují teploty v rozmezí 5-15°C a pěstují se v chladírnách;
mezofili, vyvíjejí se při teplotě 25-37 °C, zahrnují většinu bakterií.

2. Světlo. Je to znak kultivace fototrofních bakterií, protože provádějí proces fotosyntézy. Ale pro většinu mikrobů není osvětlení podmínkou. A dokonce i naopak, sluneční ultrafialové záření může potlačit jejich rozvoj.

3. Voda. Všechny mikroorganismy potřebují vodu v dostupné (tekuté) formě. To je důvod, proč se u mražených potravin nemnoží téměř žádné bakterie.

4. Kyselost prostředí. Tento princip kultivace bakterií již byl podrobně popsán výše.

5. Provzdušňování. Kyslík jako chemický prvek je nedílnou součástí vody a značného množství používaných sloučeninkultivace mikroorganismů. Plynný kyslík může být také obsažen ve vodě a jiných kapalinách v rozpuštěné formě. Významná část bakterií potřebuje neustálý přísun molekul kyslíku. Pro řadu mikroorganismů je to ale zbytečné, v horším případě je pro ně plynný kyslík toxický, protože nemají katalázu a peroxidázu, které ničí toxické produkty dýchacích cest. Nejdůležitějším krokem při kultivaci anaerobních bakterií je proto odstranění molekul O₂ ze živného média.

6. Kultivace mikroorganismů. Kultivace aerobních a anaerobních bakterií se provádí v různých vrstvách prostředí a v různých režimech.

Kultivace aerobních mikroorganismů

Kultivace aerobních bakterií vyžaduje molekulární kyslík. K získání čistých kultur aerobů, které lze úspěšně použít v lékařství a potravinářském průmyslu, se používají následující metody:

povrch rostoucí na hustých médiích nebo v kapalných médiích (jejich tenké vrstvě), když kyslík přichází přímo ze vzduchu;
hluboké kultivace v kapalných médiích, kdy se neustálým provzdušňováním dosahuje zvýšení množství v nich rozpuštěného kyslíku.

Kultivace anaerobních mikroorganismů

Základním principem kultivace bakterií tohoto typu je jejich minimální kontakt se vzdušným kyslíkem. Zajištění podmínek pro jejich růst je mnohem obtížnější než u aerobů. K izolaci anaerobů z molekulárních O₂ se používají následující metody:

Fyzické. Tento způsob kultivace anaerobních bakterií je redukován na jejich kultivaci ve speciální vakuové aparatuře - mikroanaerostatu. Vzduch v něm je nahrazen speciální plynnou směsí dusíku s přídavkem 10 % vodíku a 5 % oxidu uhličitého.
Chemický. Patří mezi ně: použití absorbujících látek (např. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) nebo redukční činidla (jako je kyselina askorbová).
Biologické. Jde o kokultivaci aerobů a anaerobů v uzavřeném systému. Tato metoda kultivace bakterií zahrnuje naočkování jedné poloviny Petriho misky některým z aerobních druhů bakterií a druhé poloviny studovaným anaerobem. Jeho vývoj začne v okamžiku, kdy se spotřebuje všechen kyslík.

Pro kultivaci anaerobních bakterií jsou vhodné následující metody výsevu:

v povrchové vrstvě;
v povrchové vrstvě naplněné sterilním parafínem;
v hustém živném médiu;
v hlubokých vrstvách viskózního média.

Získání čisté kultury

Mikrobiologové obvykle pracují se vzorky obývanými mnoha různými typy mikrobů. K určení systematického postavení mikroorganismů (čeleď, rod, druh), jakož i ke studiu jejich vlastností je však nutné je izolovat a pěstovat čistou kulturu. Mají velký význam v mnoha potravinářských odvětvích, např. sýr, chléb, kvas, víno atd. Pěstování bakterií mléčného kvašení umožňuje získatnezbytná součást pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků, těsta, kakaa, siláže a dokonce i plastů.

Metoda izolace čisté kultury v hustém médiu je založena na mechanické separaci buněk mikroorganismů s jejich následnou izolovanou kultivací. Vzorek se přenese do sterilního objemu vody nebo fyziologického roztoku (objem 10-100 ml) a poté se dvě minuty protřepává. Pro extrakci mikroorganismů nacházejících se v tloušťce zkoumaného materiálu (například uzeniny nebo sýry) se nejprve provede tření vzorků vzorků sterilními nástroji pískem. Materiál, který prošel předběžnou přípravou, o hmotnosti 1 g nebo objemu 1 ml, se zředí sterilní vodou 10, 100, 1000 atd. Stupeň ředění je zvolen tak, aby koncentrace buněk odpovídala možnostem metody.

Následnou kultivací mikroorganismů je příprava živného média. Obvykle se volí husté médium (MPA). Nejprve se roztaví a ochladí na 45-50 °C a teprve poté se nalije do několika Petriho misek (tři až pět kusů), na jejichž dno se umístí tampony z testované látky o různých koncentracích. Dále se provádí promíchání ještě nezmrzlého živného média a materiálu do něj zavedeného. Takto jsou buňky fixovány v různých bodech objemu substrátu.

Poté se Petriho misky umístí na 2 dny do termostatu při 22 °C. Během této doby se buňky rozmnoží do takové míry, že se kolonie tvořená každou z buněk stane viditelnou pouhým okem. Každá z nich je čistou kulturou typu bakterií, z jejichž buněk pocházírůže.

Poté jsou mikroorganismy z Petriho misek subkultivovány do samostatných zkumavek naplněných živným médiem. Tímto způsobem se ze smíšeného vzorku izolují čisté kultury. Tato metoda nese jméno svého vývojáře - R. Kocha. Běžně se jí také říká kalíšková metoda neboli vyčerpávající výsev. Po získání čistých kultur různých typů bakterií se určí jejich tvar, spory a rodiny.

Veškerá práce musí být provedena podle zásad asepse. Aby se zabránilo předčasnému vývoji mikroorganismů, měla by být studie provedena ihned po odběru vzorků. Voda z vodovodu se analyzuje po vypuštění prvních částí, protože mohou obsahovat mikroby nahromaděné v potrubí a kohoutcích. Mikroflóra ovoce, bobulovin a zeleniny se nachází především na povrchu (slupce), proto se z ní provádějí mytí. Za tímto účelem umístěte plod do sterilní nádoby a naplňte ji požadovaným množstvím vody. Pak se docela energicky protřepou a voda se přelije do jiné nádoby. Plodiny z látkových produktů se také získávají ve stěrech, ale předtím se z nich vyříznou kousky dané velikosti.