Gramovo barvení je široce používáno v mikrobiologii, protože je to jeden z nejjednodušších způsobů, jak odlišit bakterie na základě složení jejich buněčné stěny. Podle Grama lze všechny bakterie rozdělit na grampozitivní (Gram (+)) a gramnegativní (Gram (-)). Metoda Gramova barvení byla vyvinuta v roce 1884 a od té doby neztratila na popularitě, i když byla několikrát modifikována.
Struktura buněčné stěny
Gramovo barvení odhalí, zda je bakterie Gram-pozitivní nebo Gram-negativní. Rozdělení bakterií na Gram (+) a Gram (-) se provádí v souladu se strukturou jejich buněčné stěny.
Buněčná stěna obsahuje největší množství peptidoglykanu (mureinu) - komplexní látky, která zahrnuje peptapeptid a glykan. Glykan se skládá ze střídajících se zbytků N-acetylglukosaminu a N-acetylmuramové kyseliny, které jsou navzájem spojeny pomocí β-1,4-glykosidické vazby. Peptidoglykan zajišťuje udržení tvaru buněk, osmotickou ochranu a antigenní funkce.
Hlavní rozdíly mezi grampozitivními a gramnegativními bakteriemi
Různé bakterie mají různou tloušťku vrstvy peptidoglykanu. U bakterií, které jsou klasifikovány jako grampozitivní, se pohybuje od 15 do 80 nm, zatímco u gramnegativních od 2 do 8 nm. Gramnegativní bakterie mají zároveň pod vrstvou peptidoglykanu speciální strukturu, kterou grampozitivní bakterie nemají - periplazmatický prostor. Tento prostor vyplňují hydrolytické enzymy – β-laktamáza, ribonukleáza 1, fosfatáza. Právě tyto enzymy jsou zodpovědné za rezistenci gramnegativních bakterií vůči mnoha antibiotikům.
Gram(-) peptidoglykanová vrstva bakterií je vázána na lipopolysacharid, antigenní strukturu obsahující endotoxin. V Gram(+) bakteriích plní teichoové kyseliny podobné funkce.
Gramnegativní bakterie mají další strukturu – vnější membránu.
Podstata metody barvení
Než začnete s barvením, připraví se nátěry studovaných bakterií. K tomu se na podložní sklíčko nakape voda a přidá se tam kultura mikroorganismů s bakteriální smyčkou. Poté, po úplném zaschnutí vody, se stěr zafixuje - podložní sklíčko se několikrát přenese nad plamen hořáku. Gramovo barvení je účinnější než barvení živými bakteriemi – molekuly barviva se lépe vážou na mrtvé buňky.
Obarvení se provádí v několika fázích:
- Malé kousky filtračního papíru se umístí na pevný stěr a nalije se hlavní barvivo - genciánová violeť nebo methylenová modř.
- Po 3-5 minutách odstraňte barevný filtrační papír a naplňte nátěr Lugolovým roztokem po dobu 1 minuty. V tomto případě přípravek ztmavne.
- Lugolův roztok se scedí a nátěr se ošetří čistým etylalkoholem: na přípravek se nakape několik kapek a po 20 sekundách se scedí. Postup se opakuje 2-3krát.
- Opláchněte testovací sklíčko destilovanou vodou.
- Vyrobte další barvení - dokončete přípravu fuchsinem. Po 1-2 minutách se barvivo smyje.
- Po zaschnutí vody prozkoumejte nátěr pod mikroskopem. Gram-pozitivní bakterie budou modrofialové, gramnegativní bakterie růžové nebo červené.
Příčiny různých vzorů barvení
Jak je popsáno výše, Gram-barvení bakterií barví gram-pozitivní bakterie modrofialové, zatímco Gram-negativní bakterie barví červené nebo růžové. Důvodem rozdílného barvení bakterií touto metodou je to, že po vstupu rozpustné formy genciánové violeti do buňky přechází barvivo do nerozpustné formy jodu. Při ošetření bakterií ethylalkoholem se působením tohoto nepolárního rozpouštědla z membrány extrahují lipidy. Membrána se pak stává porézní a již nepředstavuje významnou překážku pro vyluhování barviva. nicméněpeptidoglykan je odolnější vůči nepolárním rozpouštědlům, včetně alkoholu. Je to on, kdo zabraňuje vymývání barviva, takže bakterie se silnou vrstvou mureinu se zbarví do modrofialova (grampozitivní) a po ošetření alkoholem nemění svou barvu.
Tenká mureinová vrstva gramnegativních bakterií nedokáže udržet molekuly barviva v buňce, takže po působení alkoholu se stanou bezbarvými - skvrna gramnegativní.
Po vystavení nátěru fuchsinu zůstávají bakterie zbarvené gramem modrofialové, zatímco gramnegativní bakterie se stávají růžovočervenými.
Příklady Gram(+) a Gram(-) bakterií
Gram-negativní bakterie zahrnují sinice, sirné bakterie, železité bakterie, chlamydie, rickettsie, octové bakterie, mnoho methylobakterií, thionové bakterie, arsenitobakterie, karboxybakterie.
Bifidobakterie, mnoho vodních bakterií, streptokoky a stafylokoky jsou grampozitivní.
