Koncept imobilizovaných enzymů se poprvé objevil ve druhé polovině 20. století. Mezitím, již v roce 1916, bylo zjištěno, že sacharóza sorbovaná na uhlíku si zachovala svou katalytickou aktivitu. V roce 1953 provedli D. Schleit a N. Grubhofer první vazbu pepsinu, amylázy, karboxypeptidázy a RNázy s nerozpustným nosičem. Koncept imobilizovaných enzymů byl legalizován v roce 1971. Stalo se tak na první konferenci o inženýrské enzymologii. V současnosti je pojem imobilizované enzymy chápán v širším smyslu, než tomu bylo na konci 20. století. Pojďme se na tuto kategorii podívat blíže.
Obecné informace
Imobilizované enzymy jsou sloučeniny, které jsou uměle navázány na nerozpustný nosič. Zachovají si však své katalytické vlastnosti. V současné době je tento proces uvažován ve dvou aspektech - v rámci částečného a úplného omezení svobody pohybu proteinových molekul.
Dignity
Vědci prokázali určité výhody imobilizovaných enzymů. Působí jako heterogenní katalyzátory a lze je snadno oddělit od reakčního média. V rámci výzkumu bylo zjištěno, že použití imobilizovaných enzymů lze opakovat. Během procesu vazby mění spoje své vlastnosti. Získají substrátovou specifitu a stabilitu. Jejich činnost přitom začíná záviset na podmínkách prostředí. Imobilizované enzymy jsou odolné a mají vysoký stupeň stability. Je tisíckrát, desetitisíckrát větší než například u volných enzymů. To vše zajišťuje vysokou účinnost, konkurenceschopnost a hospodárnost technologií, ve kterých jsou přítomny imobilizované enzymy.
Média
J. Poratu identifikoval klíčové vlastnosti ideálních materiálů pro imobilizaci. Nositelé musí mít:
- Nerozpustnost.
- Vysoká biologická a chemická odolnost.
- Schopnost rychlé aktivace. Přepravci by se měli snadno stát reaktivními.
- Významná hydrofilita.
- Potřebná propustnost. Jeho indikátor by měl být stejně přijatelný pro enzymy i koenzymy, reakční produkty a substráty.
V současnosti neexistuje žádný materiál, který by plně vyhovoval těmto požadavkům. Přesto se v praxi používají nosiče vhodné k imobilizaci.určitá kategorie enzymů za specifických podmínek.
Klasifikace
V závislosti na povaze se materiály, v souvislosti s nimiž se sloučeniny přeměňují na imobilizované enzymy, dělí na anorganické a organické. Vazba mnoha sloučenin se provádí pomocí polymerních nosičů. Tyto organické materiály jsou rozděleny do 2 tříd: syntetické a přírodní. V každé z nich se zase rozlišují skupiny v závislosti na struktuře. Anorganické nosiče jsou zastoupeny především materiály ze skla, keramiky, jílu, silikagelu a grafitové černi. Při práci s materiály jsou oblíbené metody suché chemie. Imobilizované enzymy se získávají potažením nosičů filmem oxidů titanu, hliníku, zirkonia, hafnia nebo zpracováním s organickými polymery. Důležitou výhodou materiálů je snadná regenerace.
Proteinové nosiče
Nejpopulárnější jsou lipidové, polysacharidové a proteinové materiály. Mezi posledně jmenovanými je třeba zdůraznit strukturální polymery. Jedná se především o kolagen, fibrin, keratin a želatinu. Takové proteiny jsou široce distribuovány v přirozeném prostředí. Jsou cenově dostupné a ekonomické. Navíc mají velké množství funkčních skupin pro vazbu. Proteiny jsou biologicky odbouratelné. To umožňuje rozšířit použití imobilizovaných enzymů v medicíně. Mezitím mají proteiny také negativní vlastnosti. Nevýhodou použití imobilizovaných enzymů na proteinových nosičích je jejich vysoká imunogenicita a takéschopnost uvést do reakcí pouze určité jejich skupiny.
Polysacharidy, aminosacharidy
Z těchto materiálů se nejčastěji používá chitin, dextran, celulóza, agaróza a jejich deriváty. Aby byly polysacharidy odolnější vůči reakcím, jsou jejich lineární řetězce zesíťovány epichlorhydrinem. Do struktur sítě jsou volně zaváděny různé ionogenní skupiny. Chitin se hromadí ve velkém množství jako odpad při průmyslovém zpracování krevet a krabů. Tato látka je chemicky odolná a má dobře definovanou porézní strukturu.
Syntetické polymery
Tato skupina materiálů je velmi rozmanitá a dostupná. Zahrnuje polymery na bázi kyseliny akrylové, styrenu, polyvinylalkoholu, polyuretanu a polyamidových polymerů. Většina z nich je mechanicky odolná. V procesu transformace poskytují možnost měnit velikost pórů v poměrně širokém rozsahu, zavádějící různé funkční skupiny.
Metody vazby
V současné době existují dvě zásadně odlišné možnosti imobilizace. Prvním je získání sloučenin bez kovalentních vazeb s nosičem. Tato metoda je fyzikální. Další možností je vznik kovalentní vazby s materiálem. Toto je chemická metoda.
Adsorpce
S jeho pomocí se získávají imobilizované enzymy přidržením léku na povrchu nosiče díkydisperzní, hydrofobní, elektrostatické interakce a vodíkové vazby. Adsorpce byla prvním způsobem, jak omezit pohyblivost prvků. Ani nyní však tato možnost neztratila svůj význam. Kromě toho je adsorpce považována za nejběžnější imobilizační metodu v průmyslu.
Vlastnosti metody
Vědecké publikace popisují více než 70 enzymů získaných adsorpční metodou. Nosiče byly především porézní sklo, různé jíly, polysacharidy, oxidy hliníku, syntetické polymery, titan a další kovy. Ty poslední jsou nejčastěji používané. Účinnost adsorpce léčiva na nosič je určena porézností materiálu a specifickým povrchem.
Mechanismus účinku
Adsorpce enzymů na nerozpustných materiálech je jednoduchá. Dosahuje se kontaktem vodného roztoku léčiva s nosičem. Může projít statickým nebo dynamickým způsobem. Roztok enzymu se smíchá s čerstvým sedimentem, například hydroxidem titaničitým. Sloučenina se potom suší za mírných podmínek. Enzymová aktivita během takové imobilizace je zachována téměř ze 100 %. Specifická koncentrace přitom dosahuje 64 mg na gram nosiče.
Negativní momenty
Mezi nevýhody adsorpce patří nízká pevnost při vazbě enzymu a nosiče. V procesu změny reakčních podmínek lze zaznamenat ztrátu prvků, kontaminaci produktů a desorpci proteinů. Pro zlepšení sílynosiče vazby jsou předem upraveny. Zejména jsou materiály ošetřeny kovovými ionty, polymery, hydrofobními sloučeninami a jinými polyfunkčními činidly. V některých případech je modifikován samotný lék. Ale dost často to vede ke snížení jeho aktivity.
Zahrnutí do gelu
Tato možnost je zcela běžná díky své jedinečnosti a jednoduchosti. Tato metoda je vhodná nejen pro jednotlivé prvky, ale i pro multienzymové komplexy. Zapracování do gelu lze provést dvěma způsoby. V prvním případě se léčivo spojí s vodným roztokem monomeru, načež se provede polymerace. V důsledku toho se objeví prostorová gelová struktura obsahující molekuly enzymů v buňkách. Ve druhém případě se léčivo zavede do roztoku hotového polymeru. Poté se převede do gelového stavu.
Pronikání do průsvitných struktur
Podstatou této metody imobilizace je oddělení vodného roztoku enzymu od substrátu. K tomu se používá polopropustná membrána. Umožňuje nízkomolekulárním prvkům kofaktorů a substrátů procházet a zadržovat velké molekuly enzymů.
Mikroenkapsulace
Existuje několik možností pro zabudování do průsvitných struktur. Z nich je největší zájem mikroenkapsulace a inkorporace proteinů do lipozomů. První možnost navrhl v roce 1964 T. Chang. Spočívá v tom, že se roztok enzymu zavede do uzavřené kapsle, jejíž stěny jsou vyrobeny z polopropustnépolymer. Vzhled membrány na povrchu je způsoben reakcí interfaciální polykondenzace sloučenin. Jeden z nich je rozpuštěn v organické a druhý - ve vodné fázi. Příkladem je vytvoření mikrokapsle získané polykondenzací halogenidu kyseliny sebakové (organická fáze) a hexamethylendiaminu-1,6 (respektive vodná fáze). Tloušťka membrány se počítá v setinách mikrometru. Velikost kapslí je stovky nebo desítky mikrometrů.
Inkorporace do lipozomů
Tato metoda imobilizace se blíží mikroenkapsulaci. Lipozomy jsou přítomny v lamelárních nebo sférických systémech lipidových dvojvrstev. Tato metoda byla poprvé použita v roce 1970. K izolaci lipozomů z lipidového roztoku se organické rozpouštědlo odpaří. Zbývající tenký film se disperguje ve vodném roztoku, ve kterém je přítomen enzym. Během tohoto procesu dochází k samovolnému sestavení lipidových dvojvrstvých struktur. Takové imobilizované enzymy jsou v medicíně velmi oblíbené. To je způsobeno skutečností, že většina molekul je lokalizována v lipidové matrici biologických membrán. Imobilizované enzymy obsažené v liposomech jsou nejdůležitějším výzkumným materiálem v medicíně, který umožňuje studovat a popisovat vzorce životně důležitých procesů.
Vytváření nových dluhopisů
Imobilizace tvorbou nových kovalentních řetězců mezi enzymy a nosiči je považována za nejrozšířenější metodu získávání průmyslových biokatalyzátorů.destinace. Na rozdíl od fyzikálních metod poskytuje tato možnost nevratnou a silnou vazbu mezi molekulou a materiálem. Jeho vznik je často doprovázen lékovou stabilizací. Umístění enzymu ve vzdálenosti 1. kovalentní vazby vzhledem k nosiči zároveň vytváří určité potíže při realizaci katalytického procesu. Molekula je oddělena od materiálu pomocí vložky. Často se používá jako poly- a bifunkční činidla. Konkrétně jsou to hydrazin, bromkyan, dihedrid glutarové kyseliny, sulfurylchlorid atd. Například pro odstranění galaktosyltransferázy se mezi nosič a enzym vloží následující sekvence -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. V takové situaci jsou ve struktuře přítomny inzert, molekula a nosič. Všechny jsou spojeny kovalentními vazbami. Zásadní význam má potřeba zavést do reakce funkční skupiny, které nejsou podstatné pro katalytickou funkci prvku. Glykoproteiny jsou tedy zpravidla připojeny k nosiči nikoli prostřednictvím proteinu, ale prostřednictvím sacharidové části. Výsledkem jsou stabilnější a aktivnější imobilizované enzymy.
Cells
Výše popsané metody jsou považovány za univerzální pro všechny typy biokatalyzátorů. Mezi ně patří mimo jiné buňky, subcelulární struktury, jejichž imobilizace je v poslední době velmi rozšířená. Důvodem je následující. Když jsou buňky imobilizovány, není potřeba izolovat a čistit enzymové přípravky nebo zavádět kofaktory do reakcí. V důsledku toho je to možnésystémy, které provádějí vícestupňové nepřetržité procesy.
Použití imobilizovaných enzymů
Ve veterinární medicíně, průmyslu a dalších ekonomických sektorech jsou léky získané výše uvedenými metodami velmi oblíbené. Přístupy vyvinuté v praxi poskytují řešení problémů cíleného dodávání léčiv do organismu. Imobilizované enzymy umožnily získat léky s prodlouženým účinkem s minimální alergenitou a toxicitou. V současné době vědci řeší problémy spojené s biokonverzí hmoty a energie pomocí mikrobiologických přístupů. Mezitím k práci významně přispívá i technologie imobilizovaných enzymů. Vyhlídky na rozvoj se zdají být poměrně široké. Jednou z klíčových rolí v procesu monitorování stavu životního prostředí by tedy v budoucnu měly být nové typy analýz. Zejména mluvíme o bioluminiscenčních a enzymových imunoanalytických metodách. Pokročilé přístupy jsou zvláště důležité při zpracování lignocelulózových surovin. Imobilizované enzymy mohou být použity jako zesilovače slabého signálu. Aktivní centrum může být pod vlivem nosiče, který je pod ultrazvukem, mechanickým namáháním nebo podléhá fytochemickým přeměnám.
